豬傳染性胃腸炎病毒膜蛋白單克隆抗體的制備與抗原表位的鑒定.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(transmissible gastroenteritis of swine，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV)感染引起傳染病，能夠引起仔豬典型胃腸道癥狀甚至死亡。TGEV基因組為不分段的單股正鏈RNA，共編碼四種結(jié)構(gòu)蛋白。目前，對(duì)TGEV的纖突糖蛋白S抗原表位的研究非常深入，但是針對(duì)膜糖蛋白M抗原表位仍有待深入研究。

2、>　　 本研究首先通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增了去除信號(hào)肽的M基因，并將其插入原核表達(dá)載體pGEX-6p-1。通過(guò)優(yōu)化蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條件，使pGEX-M在“37℃、IPTG終濃度0.5 mM、誘導(dǎo)6h”的條件下，在宿主菌Rossetta中成功表達(dá)了重組TGEV M蛋白。純化的重組TGEV M蛋白為制備抗M蛋白單克隆抗體提供了確實(shí)的實(shí)驗(yàn)材料。
　　 同時(shí)，以超速離心得到的TGEV顆粒為免疫原、按照經(jīng)典的單克隆抗體制備方法，成功制備了一

3、株能夠產(chǎn)生抗TGEV M蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為7G7。間接免疫熒光結(jié)果證明，抗M蛋白單克隆抗體可以識(shí)別天然狀態(tài)下的TGEV顆粒;Western blot結(jié)果證明，7G7上清也可以與變性條件下的重組M蛋白發(fā)生反應(yīng);對(duì)單克隆抗體針對(duì)的抗原位點(diǎn)進(jìn)行初步分析，間接ELISA結(jié)果表明，抗原位點(diǎn)位于病毒囊膜外側(cè);對(duì)單克隆抗體特異性分析，結(jié)果顯示，7G7上清僅與TGEV發(fā)生反應(yīng)、并不識(shí)別其它豬源病毒。以上結(jié)果證明，抗M單克隆抗體可以作為M

4、蛋白抗原位點(diǎn)篩選的良好靶分子。
　　 隨后以純化的腹水為靶分子，通過(guò)4輪優(yōu)化的噬菌體篩選步驟，最后隨機(jī)挑取10個(gè)噬菌體藍(lán)斑進(jìn)行擴(kuò)增、滴度測(cè)定，并檢測(cè)它們與靶分子的親和能力。親和能力檢測(cè)結(jié)果顯示，10個(gè)隨機(jī)噬菌體與靶分子之間都具備高度親和能力。對(duì)源于10個(gè)隨機(jī)噬菌體的靶向序列進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，10個(gè)隨機(jī)噬菌體均攜帶相同的外源12肽“VHIDPHHQHDQM”，并命名為phage-V。將外源12肽與M蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)12肽與

5、M蛋白第197至210位氨基酸具有一定的相似性，其中有三個(gè)相近位點(diǎn)的氨基酸完全一致（第199位I、第200位D和第203位P）。最終，競(jìng)爭(zhēng)性阻斷的結(jié)果表明，phage-V對(duì)TGEV或重組M蛋白與單抗的結(jié)合起阻斷作用，而且這種阻斷效果與phage-V的投入量呈正相關(guān)。綜合以上結(jié)果可以證明，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選出的12肽VHIDPHHQHDQM，既可以直接與抗M蛋白單克隆抗體結(jié)合，又可以競(jìng)爭(zhēng)性地阻斷病毒或M蛋白與抗體之間的結(jié)合，說(shuō)明該12