表達豬流行性腹瀉病毒中和抗原區(qū)重組乳酸乳球菌系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是冠狀病毒家庭成員。豬流行性腹瀉病毒感染豬的腸道上皮細胞而引起嚴重腹瀉，尤其對于仔豬，感染后死亡率幾乎為100％。該病是以發(fā)病豬嘔吐、腹瀉、嚴重脫水為臨床特征的高度接觸性腸道傳染病。在世界范圍內(nèi)分布，呈地方流行性，尤其在東亞各國流行更為廣泛，是各養(yǎng)豬國家導致仔豬早期死亡的重要疫病之一。
　　 針對豬流行性腹瀉病毒經(jīng)黏膜感染的特點，研制能有

2、效的刺激黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生局部免疫應答，進一步引起全身性系統(tǒng)免疫反應的疫苗，對該病的防治具有重要意義。
　　 本研究以乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000作為遞呈抗原的活菌載體，以豬流行性腹瀉病毒免疫保護性抗原S蛋白部分基因片段ps420（499-638aa）為靶基因，構(gòu)建了表達豬流行性腹瀉病毒ps420基因的重組乳酸乳球菌表達系統(tǒng)。
　　 以含有豬流行性腹瀉病毒ps420基因的質(zhì)粒pPG612.1

3、-ps420為模板，PCR擴增出約420bp的目的基因ps420，并克隆到pMD18-T simple載體，進行酶切、PCR鑒定，重組質(zhì)粒命名為pMD18-TS-ps420。重組質(zhì)粒與表達載體均經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切，回收目的基因片段ps420與表達載體pNZ8112連接，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)NZ9000，篩選陽性克隆進行酶切、PCR和測序鑒定，重組質(zhì)粒命名pNZ8112-ps420，重組乳酸乳球菌pNZ8112-ps420/NZ9000。

4、>　　 重組菌pNZ8112-ps420在GM17（含氯霉素）培養(yǎng)液中培養(yǎng)，經(jīng)Nisin誘導目的蛋白的表達。重組菌中蛋白的表達及表達蛋白的定位通過SDS-PAGE、Western blotting和間接免疫熒光進行鑒定?？捡R斯亮藍染色結(jié)果顯示：pNZ8112-ps420的菌體裂解物表達了15KD的融合蛋白，誘導后表達的ps420蛋白經(jīng)Western-blot分析，可檢測到特異性反應條帶。
　　 將重組菌免疫接種家兔，每只家兔經(jīng)