小麥幼胚農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化.pdf

1、分類號(hào)：$5121密級(jí)：公玨單位代碼：學(xué)號(hào)：100862009305小麥幼胚農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化OptimizationotAg礦obacteri優(yōu)”1MediatedTransformationusingWheatimmatureembryos學(xué)位申請(qǐng)人：指導(dǎo)教師：學(xué)科專業(yè)：學(xué)位類別：授予單位：答辯B期：武海娜溫樹(shù)敏研究員劉桂茹教授植物資源學(xué)農(nóng)學(xué)碩士河北農(nóng)業(yè)大學(xué)二。一二年五月二十五日摘要小麥幼胚培養(yǎng)能力高、植株再生能力強(qiáng)，被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因

2、最理想的外植體材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行小麥幼胚遺傳轉(zhuǎn)化研究有助于推動(dòng)小麥基因工程育種的進(jìn)程。本研究以不同小麥基因型的幼胚為受體材料，通過(guò)篩選高培養(yǎng)力基因型，改良誘導(dǎo)培養(yǎng)基和愈傷分化再生等途徑，優(yōu)化了小麥幼胚組織培養(yǎng)高頻再生體系。在此基礎(chǔ)上采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對(duì)小麥幼胚愈傷組織進(jìn)行EeAP2，J、OsDREB22等抗逆轉(zhuǎn)錄因子的遺傳轉(zhuǎn)化，并對(duì)影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素進(jìn)行了研究，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系。獲得的主要研究結(jié)果如下

3、：1通過(guò)對(duì)不同基因型小麥材料進(jìn)行幼胚愈傷組織誘導(dǎo)及分化再生試驗(yàn)，明確了小麥的胚齡、基因型、幼胚愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基、生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是影響小麥幼胚愈傷組織形成和分化再生的重要因素，確定了在保定地區(qū)河農(nóng)827等4個(gè)冬小麥品種幼胚的最佳培養(yǎng)時(shí)期為胚齡12～16d；NO17、DIC、Wl、W2四種改良培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷效果較好；最佳分化培養(yǎng)基激素配比：10mg／LKT02—04mg／LNAA；篩選出4個(gè)適合小麥幼胚培養(yǎng)和植株再生的基因型材料，初步優(yōu)化

4、了小麥幼胚愈傷組織再生體系。2對(duì)14個(gè)小麥基因型進(jìn)行農(nóng)桿菌敏感性檢測(cè)分析，組織化學(xué)染色結(jié)果表明，河農(nóng)827的愈傷對(duì)農(nóng)桿菌侵染比較敏感，GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)9191％。利用混合『F交發(fā)計(jì)L8(4‘24)對(duì)河農(nóng)827進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究，得到最佳轉(zhuǎn)化條件為愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基W2上誘導(dǎo)培養(yǎng)6d，農(nóng)桿菌OD660=1時(shí)進(jìn)行侵染3h。明確了篩選體系中抗生素的適宜添加濃度為25mg／LG418250mg／Lcarb；用含有抗生素的PCM液體培養(yǎng)基洗

5、滌共培養(yǎng)后的愈傷，能夠減小對(duì)愈傷造成的損傷，獲得較多的抗性愈傷；采用22℃條件下濾紙上培養(yǎng)3d的共培養(yǎng)方式以及農(nóng)桿菌侵染液中加入001％的表面活性劑聚醚F68，能夠減小愈傷褐化率，：肓助于提高小麥愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率；在生根培養(yǎng)基上添加lm∥LIBA，解決了農(nóng)桿菌侵染后再生苗不易生根的難題，初步優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系。3利用優(yōu)化的小麥幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系將EeAP2一J『J『、OsDREB22抗逆轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入小麥幼胚愈傷組織中