無(wú)載體骨架無(wú)選擇標(biāo)記玉米轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化.pdf

1、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究和新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)已取得了突破性進(jìn)展，在解決人類(lèi)面臨的環(huán)境污染、資源短缺等問(wèn)題顯示出巨大的作用。但是，近年來(lái)隨著人們對(duì)生物安全性的關(guān)注，載體骨架序列和選擇標(biāo)記基因作為“垃圾DNA”影響著轉(zhuǎn)基因植物的安全性評(píng)價(jià)。因此，建立無(wú)載體骨架無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為植物基因工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。雖然花粉管通道法可以將線性DNA片段導(dǎo)入植物基因組，直接獲得無(wú)載體骨架無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株，但其轉(zhuǎn)化率和可重復(fù)性有待提高。 玉米

2、是重要的糧食兼飼料作物，在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有非常重要的地位。本研究以玉米為試材，在花粉管通道法基礎(chǔ)上建立并優(yōu)化了子房滴注轉(zhuǎn)化方法，其操作要點(diǎn)是將DNA轉(zhuǎn)化溶液直接滴加在完全去除花柱的子房上。首先通過(guò)苯胺蘭染色觀察花粉管確定轉(zhuǎn)化操作開(kāi)始時(shí)間為授粉后16 h，然后利用子房滴注法轉(zhuǎn)化無(wú)載體骨架無(wú)選擇標(biāo)記的線性GFP基因轉(zhuǎn)化元件(GFP基因表達(dá)框兩側(cè)分別包含25bp T-DNA左右邊界序列)。對(duì)FITC標(biāo)記的線性轉(zhuǎn)化元件進(jìn)行顯微觀察和示蹤，結(jié)果

3、表明子房滴注法與花粉管通道法相比，縮短了外源DNA進(jìn)入胚囊的路徑和時(shí)間；轉(zhuǎn)化緩沖液0.05％ Silwet L-77+5％sucrose縮短了外源DNA進(jìn)入胚囊的時(shí)間并加大進(jìn)入量。通過(guò)PCR檢測(cè)，確定適合子房滴注法轉(zhuǎn)化的玉米品種為9818，最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間為授粉后18～20 h，最佳轉(zhuǎn)化緩沖液成分為0.05％ Silwet L-77+5％ sucrose，在此條件下PCR陽(yáng)性率達(dá)到6.47％。 本研究進(jìn)一步對(duì)線性GFP基因轉(zhuǎn)化元件在

4、轉(zhuǎn)基因植物基因組中的整合方式、拷貝數(shù)、表達(dá)情況和后代遺傳規(guī)律進(jìn)行了分析。Southern blot結(jié)果表明GFP基因以低拷貝數(shù)、簡(jiǎn)單的方式(1～3條Southern雜交帶)整合到玉米基因組；Northern blot結(jié)果表明GFP基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)；在轉(zhuǎn)基因植株的根和幼胚中觀察到GFP表達(dá)；轉(zhuǎn)基因植株的后代遺傳分析表明GFP基因能夠遺傳至T2代并正常表達(dá)，部分轉(zhuǎn)基因株系中的GFP基因以孟德?tīng)栠z傳方式傳遞給T1代，但T2代不符合孟德?tīng)柗?/p>

5、離比。 為了驗(yàn)證玉米子房滴注法的可重復(fù)性，本研究將分別包含T-DNA邊界和LKR/SDH(lysine-ketoglutarate reductase/saccharopine dehydrogenase)邊界的線性GUS基因轉(zhuǎn)化元件(LKR/SDH基因5’端部分序列-CaMV35S-GUS基因-nos-LKR/SDH基因3’端部分序列)轉(zhuǎn)化玉米，PCR陽(yáng)性率分別為7.2％和11.5％。結(jié)果表明，玉米來(lái)源的LKR/SDH基因部分

6、序列作為線性轉(zhuǎn)化元件的邊界可提高轉(zhuǎn)化率；子房滴注法由于規(guī)范了操作要點(diǎn)、確定了最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間和轉(zhuǎn)化緩沖液而具有較高的轉(zhuǎn)化率和良好的重復(fù)性。對(duì)包含LKR/SDH邊界的線性GUS基因轉(zhuǎn)化元件在轉(zhuǎn)基因植物中的整合、表達(dá)和遺傳規(guī)律也進(jìn)行了分析，Southern blot結(jié)果表明GUS基因以簡(jiǎn)單的方式(1～2條Southern雜交帶)整合到玉米基因組；RT-PCR結(jié)果表明GUS基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)；組織化學(xué)染色結(jié)果表明GUS基因在轉(zhuǎn)基因植株的根、葉和

7、幼胚中正常表達(dá)；對(duì)4個(gè)T1代轉(zhuǎn)基因株系的組織化學(xué)染色和PCR檢測(cè)結(jié)果表明，GUS基因以孟德?tīng)柗蛛x方式遺傳并正常表達(dá)。 由于子房滴注法的轉(zhuǎn)化率受到不同玉米品種子房外部形態(tài)的影響，為了完善無(wú)載體骨架無(wú)選擇標(biāo)記的玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系，本研究利用花粉管通道法轉(zhuǎn)化線性GFP基因轉(zhuǎn)化元件，并建立了簡(jiǎn)便、高效的檢測(cè)方法。首先確定玉米花粉管通道法的操作要點(diǎn)：授粉后17～18 h，與穗軸頂部相齊切掉花柱和苞葉，將轉(zhuǎn)化元件溶液滴加在花柱上。通過(guò)觀察GF

8、P在幼胚中的表達(dá)確定花粉管通道法的轉(zhuǎn)化部位(籽粒位于玉米果穗的5～8圈)；然后利用PCR檢測(cè)和觀察GFP表達(dá)從位于轉(zhuǎn)化部位的籽粒中篩選轉(zhuǎn)基因植株，檢出率提高到4.96％，并進(jìn)一步驗(yàn)證了花粉管通道法的轉(zhuǎn)化部位；Southern blot結(jié)果表明GFP基因以簡(jiǎn)單的方式整合到玉米基因組；Northern blot結(jié)果表明GFP基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。 本研究建立了具有較高轉(zhuǎn)化率的子房滴注轉(zhuǎn)化法和適用于花粉管通道轉(zhuǎn)化的簡(jiǎn)便、高效的檢測(cè)方法