蠟梅的離體培養(yǎng)及其遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化.pdf

1、蠟梅原名黃梅，是蠟梅科蠟梅屬的落葉叢生灌木。蠟梅起源古老，種類較少，是第三紀(jì)孑遺植物和國(guó)家二級(jí)珍稀瀕危植物。蠟梅是中國(guó)的傳統(tǒng)名花，也是常用的園林綠化植物，它與梅花、山茶、水仙一起被稱為“雪中四友”。蠟梅不僅具有較高的觀賞性，還能作為經(jīng)濟(jì)植物、環(huán)保植物和藥用植物被人們加以利用。雖然蠟梅的栽培歷史悠久，但對(duì)它的開發(fā)研究利用主要是從20世紀(jì)80年代開始，且主要集中在國(guó)內(nèi)，研究范圍從宏觀的種質(zhì)資源、形態(tài)分類到微觀的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)等內(nèi)容均有涉

2、及。近年來(lái)植物離體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，更為蠟梅的開發(fā)利用提供了新的途徑。蠟梅常用的繁殖方法有嫁接、分株和播種繁殖，但這些常規(guī)繁殖技術(shù)要求嚴(yán)格，繁殖系數(shù)較低。通過(guò)離體培養(yǎng)，不僅可以對(duì)蠟梅能進(jìn)行快繁及種質(zhì)資源保存，同時(shí)也能為蠟梅的基因工程奠定基礎(chǔ)。但相對(duì)于草本植物，木本植物的組培研究起步較晚并且不夠深入，通過(guò)組培進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)的樹種還比較少。作為一種木本花卉植物，蠟梅的組織培養(yǎng)存在著一定難度，比如它的再生分化比較困難，在組培過(guò)程中容易

3、褐化等。而通過(guò)研究和建立蠟梅的遺傳轉(zhuǎn)化體系，則可以打破常規(guī)育種的限制，縮短育種年限，對(duì)蠟梅的抗性以及花色、花形等性狀進(jìn)行改良，培育出新品種，從而使蠟梅這一古老植物煥發(fā)出新的光彩。 目前國(guó)內(nèi)有關(guān)蠟梅的組培報(bào)道主要集中在探索它的快繁技術(shù)上，未見(jiàn)通過(guò)分化建立蠟梅再生體系的報(bào)道，有關(guān)蠟梅遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的研究也沒(méi)有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在采用蠟梅無(wú)菌苗子葉作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的形成與分化，并以此為基礎(chǔ)初步建立并優(yōu)化蠟梅的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

4、 (1)蠟梅的離體培養(yǎng)以蠟梅種子無(wú)菌苗子葉作為外植體，以改良MS和MS作為基本培養(yǎng)基，添加不同激素組合，篩選出誘導(dǎo)蠟梅愈傷組織產(chǎn)生和分化的最佳培養(yǎng)基，建立起蠟梅的再生體系。將種子無(wú)菌苗半展開的子葉切成1 cm×1 cm的方塊，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)和分化，再將分化出的芽切下接種于增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，待苗長(zhǎng)到3～4 cm高時(shí)，切掉基部愈傷，接于生根培養(yǎng)基中生根。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，改良MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0

5、.5 mg/L+KT0.5 mg/L+IBA0.2 mg/L+2，4-D0.2 mg/L能誘導(dǎo)蠟梅愈傷組織的產(chǎn)生和分化，分化率為11.7％；再生植株在改良MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L上增殖系數(shù)最高，能達(dá)到2.7：1/2MS+NAA0.1 mg/L能有效促進(jìn)蠟梅生根，生根率在80％以上，而在未添加激素的1/2MS中蠟梅生根緩慢，生根率僅為10％。 (2)蠟梅遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步建立及優(yōu)化以蠟梅的愈傷組織作為外植體，

6、確定Cef,Km的篩選壓，并利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法將GUS基岡轉(zhuǎn)入蠟梅愈傷組織之中，初步建立起蠟梅的遺傳轉(zhuǎn)化體系。通過(guò)GUS基因瞬時(shí)表達(dá)的檢測(cè)，探討了農(nóng)桿菌菌液濃度，侵染時(shí)間，不同類型侵染液，侵染液中AS的添加以及共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蠟梅轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明以上因素是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蠟梅遺傳轉(zhuǎn)化的重要影響因子。在農(nóng)桿菌EHA105-pIG121介導(dǎo)轉(zhuǎn)化蠟梅的體系中，Cef的篩選壓為200mg/L，Km的篩選壓為35 mg/L，優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化方

7、法為：將蠟梅愈傷組織切成1 cm×1cm大小，在培養(yǎng)基改良MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.5 mg/L+IBA0.2 mg/L+2，4-D0.2 mg/L上黑暗預(yù)培養(yǎng)3d。將第二次活化后OD<,600>值為0.4的農(nóng)桿菌菌液離心后收集菌體，加入液體MS+AS100μmol/L，重懸到OD<,600>為0.4。將預(yù)培養(yǎng)后的愈傷組織置于重懸后的菌液中，在搖床上振蕩侵染10min，在超凈工作臺(tái)上用滅菌濾紙將愈傷

8、組織表面菌液吸干，再次接種于培養(yǎng)基改良MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.5mg/L+IBA0.2 mg/L+2，4-D0.2 mg/L中黑暗共培養(yǎng)2d。2d左右愈傷組織周圍開始出現(xiàn)菌斑，此時(shí)，將愈傷組織放于液體MS+Cef1000 mg/L中脫菌2h，然后用無(wú)菌水沖洗愈傷5次，放于滅菌紙上將水吸干，然后接種于改良MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.5mg/L+IBA0.2 mg/L