紅掌‘阿拉巴馬’低溫相關(guān)基因AOX、CAT和APX的表達分析、功能驗證及遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建.pdf

1、紅掌(Anthurium andraeanum)是天南星科花燭屬高檔室內(nèi)觀賞盆花，屬佛焰花序類植物。紅掌由于花型奇特、顏色鮮艷多彩而深受人們喜愛，是居家裝飾和饋贈親友的最好選擇，在盆花市場特別是年宵花市場上占了很大比例，因此在浙江省的種植面積正在迅速擴增。而且隨著人們生活水平的不斷提高，消費理念的轉(zhuǎn)變，對高檔盆花的需求越來越大，市場還有著巨大潛力。然而由于紅掌原產(chǎn)熱帶，對溫度較為敏感，生長溫度要求15℃以上，低于12℃容易產(chǎn)生冷害，低溫

2、是限制紅掌生長發(fā)育的重要逆境因子。在我省種植存在高能耗、高成本的問題，降低了市場競爭力，影響了紅掌盆花產(chǎn)業(yè)的持續(xù)、健康的發(fā)展。要解決這個問題的最根本途徑就是采用育種手段從根本上提高紅掌的抗寒性，對于我省的花卉產(chǎn)業(yè)的做大做強則顯得十分必要和緊迫。本研究采用PCR結(jié)合RACE技術(shù)，以紅掌‘阿拉巴馬’為材料，從其葉片中克隆得到交替氧化酶AOX、過氧化氫酶CAT和抗壞血酸過氧化物酶APX3個基因全長，并對其進行生物信息學分析;運用實時定量PCR

3、技術(shù)分析各基因在紅掌不同組織器官和不同低溫脅迫下的表達情況;構(gòu)建了紅掌抗壞血酸過氧化物酶基因的植物表達載體，并轉(zhuǎn)化煙草進行功能驗證;最后，將脂肪酸去飽和酶基因轉(zhuǎn)化紅掌并獲得了抗性植株。取得的研究結(jié)果如下:
　　 1、紅掌交替氧化酶基因AnAOX全長基因的克隆與序列分析
　　 從紅掌葉片中克隆與低溫脅迫相關(guān)的基因AOX,其全長序列為1170 bp，命名為AnAOX（GenBank登錄號:JX163297），該基因含有103

4、8 bp的開放閱讀框，編碼345個氨基酸，AnAOX編碼蛋白預測的等電點(pI)為8.51，分子量大小約為38.0 kD。利用DNAMAN5.2.2軟件，分析AnAOX基因編碼的氨基酸序列，認為該基因具有完整的3'和5'末端，是花燭屬紅掌交替氧化酶基因的全長序列。紅掌AOX推測的氨基酸序列與馬鈴薯（Solanum tuberosum）、水芭蕉（Lysichiton camtschatcensis）、羽葉蔓綠絨(Philodendronb

5、ipinnatifidum)和腎葉臭菘（Symplocarpus renifolius）的AOX的同源性分別為82％、80％、78％和77％。所有的序列中都存在完全保守的鐵離子結(jié)合區(qū)域和組氨酸殘基，它們可能與AOX基因在植物中的功能密切相關(guān)。
　　 2、紅掌過氧化氫酶基因AnCAT基因的克隆與序列分析
　　 以紅掌‘阿拉巴馬’品種葉片提取的總RNA為模板，通過RT-PCR與RACE擴增，獲得一個1704 bp的過氧化氫酶

6、(Catalase，CAT)基因的cDNA序列，其基因編碼區(qū)共1476 bp，編碼492個氨基酸，命名為AnCAT(GenBank登錄號:JX163298)。AnCAT編碼蛋白預測的等電點(pI)為6.89，相對分子量約為57.1 kD。紅掌CAT推測的氨基酸序列與與馬蹄蓮（Zantedeschia aethiopica）、油棕（Elaeis guineensis）、小果野蕉（Musaacuminata）和秈稻(Oryza sativa

7、 Indica)的CAT的同源性分別為91％、87％、87％和81％。
　　 3、紅掌抗壞血酸過氧化物酶基因AnAPX基因的克隆與序列分析
　　 以天南星科花燭屬紅掌‘阿拉巴馬’品種葉片提取的總RNA為模板，通過RT-PCR與RACE擴增，獲得一個888 bp的抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)基因的cDNA序列，其基因編碼區(qū)共750bp，編碼250個氨基酸，命名為AnAPX(GenB

8、ank登錄號:JQ8385071)。根據(jù)Protparam在線軟件預測紅掌抗壞血酸過氧化物酶蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明推測APX蛋白的分子式為C1232H1904N330O363S7，相對分子量約為27.4kD，等電點(pI)為5.40;理論推導半衰期約30h，不穩(wěn)定參數(shù)為32.55，屬于穩(wěn)定蛋白。紅掌APX推測的氨基酸序列與馬蹄蓮（Zantedeschia aethiopica）、華東葡萄（Vitispseudoreticulata）、

9、棉花（Gossypium hirsutum）、油棕（Elaeis guineensis）和玉米（Zea mays）的APX的同源性分別為93％、87％、87％和86％。
　　 4、紅掌AnAOX、 AnCAT和AnAPX基因的表達分析
　　 通過定量PCR研究上述三個基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達與紅掌葉片低溫脅迫之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，6℃處理后，紅掌葉片AnAOX、 AnCAT和AnAPX基因均上調(diào)表達。其中AnAOX基因在低溫處理1

10、2 h后上調(diào)表達不明顯，處理24 h后開始明顯上調(diào)表達，且處理24 h表達量顯著高于12 h;低溫處理超出24 h后，表達量略有下降，36～48 h之間表達量沒有明顯差異。AnCAT基因在低溫處理12h后表達明顯上調(diào)，超過12h表達量開始下降，當?shù)蜏靥幚頃r間達到48 h時，表達量與對照接近甚至略低于對照;AnAPX基因在低溫處理12h明顯上調(diào)表達，且隨著低溫處理時間的延長，上調(diào)表達逐漸上升，當處理48 h后上調(diào)表達達到頂峰。由此推測，紅

11、掌AnAPX基因表達量的變化與低溫及低溫持續(xù)時間關(guān)系最密切，其次是AnAOX基因、AnCAT基因。
　　 5、紅掌AnAPX植物表達載體的構(gòu)建
　　 根據(jù)AnAPX基因全長序列設計特異引物，以紅掌‘阿拉巴馬’葉片為試材，得到AnAPX基因完整的開放閱讀框。將擴增到的片段與pMD18-T載體連接并進行序列測定，表明插入片段正確?？寺∑谓?jīng)雙酶切消化插入到植物表達載體pCAMBIA2300中，構(gòu)建了AnAPX基因的表達載體。

12、在成功構(gòu)建AnAPX表達載體后，采用電擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌株中，為后續(xù)AnAPX功能驗證莫定了基礎(chǔ)。
　　 6、紅掌基因轉(zhuǎn)化
　　 采用根癌農(nóng)桿菌介導法，以紅掌愈傷組織為侵染材料，將綠色熒光蛋白基因GFP和脂肪酸去飽和酶基因FAD3轉(zhuǎn)化紅掌，通過G418和卡那霉素篩選，獲得了轉(zhuǎn)基因紅掌植株。用PCR反應對具卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因紅掌植株進一步鑒定，結(jié)果表明目的基因FAD3已經(jīng)整合到部分轉(zhuǎn)基因植株的基因組中，成功