抗菌肽LfcinB15-W4，10多拷貝表達載體的構建及融合表達.pdf

1、隨著傳統(tǒng)抗生素的廣泛使用，關于藥物殘留和菌株耐藥性等問題的爭論日益激烈。研究與開發(fā)更為有效，同時對人、動物及環(huán)境安全無害的傳統(tǒng)抗生素替代品是當今科研領域的研究熱點之一。抗菌肽由于具有有效的抗菌活性及獨特的抗菌機制，在替代傳統(tǒng)抗生素方面顯示了巨大潛力。牛乳鐵蛋白肽(BovineLactoferricin，LfcinB)及其衍生肽具有高效廣譜抗菌等多種生物學功能。其衍生肽LfcinB15-W4,10是由15個氨基酸殘基組成的陽離子型抗菌肽，

2、由于氨基酸序列的優(yōu)化，其功能活性較LfcinB有所提高，且本身不含稀有氨基酸和外源化學成分，所以是一種極具應用潛力的健康安全的抗菌替代物。本研究比較了LfcinB15-W4,10和常用抗生素的體外抑菌活性，通過基因工程技術表達LfcinB15-W4,10，為大規(guī)模生產(chǎn)LfcinB15-W4,10奠定了理論與實踐基礎。本研究主要結論如下： 在體外抑菌實驗中，化學合成LfcinB15-W4,10的總體抑菌效果比青霉素、金霉素、鏈霉素

3、、多西環(huán)素稍差，但是仍然對測試菌株表現(xiàn)出較強的抑菌活性。根據(jù)LfcinB15-W4,10氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性設計合成編碼基因，設計非對稱粘性末端5'-CCGA/5'-TCGG，在T4DNA連接酶作用下首尾串聯(lián)成多聚體編碼序列。分別設計含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點的接頭，將多聚體編碼基因定向插入表達載體pET32a，構建重組表達載體pET32a-(LfcinB15-W4,10)n。經(jīng)菌落PCR和DNA測序驗證后得到含

4、有單拷貝至七拷貝和九拷貝編碼基因的轉化子。IPTG誘導表達，蛋白質電泳分析結果表明不同拷貝數(shù)的多聚體融合蛋白得到特異性誘導表達，其中四聚體融合蛋白表達水平最高，占菌體總蛋白的45％。經(jīng)Ni2+親和層析柱純化回收四聚體融合蛋白，純度達到86.3％以上，每1升細菌培養(yǎng)物可得到約73mg融合蛋白。按照每毫克四聚體融合蛋白加入5單位凝血酶進行裂解，在25℃保溫48h可實現(xiàn)完全裂解，經(jīng)電洗脫回收得到純度在99％以上的LfcinB15-W4,10四

5、聚體。利用薄層瓊脂擴散法檢測重組LfcinB15-W4,10四聚體抑菌活性，對金黃色葡萄球菌ATCC25923具有明顯的抑制作用。經(jīng)微量肉湯稀釋法測定其對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度(MIC)為16μg/mL。 本實驗成功實現(xiàn)了抗菌肽牛乳鐵蛋白肽衍生肽LfcinB15-W4,10在大腸桿菌BL21(DE3)中的串聯(lián)融合表達，平均每升細菌培養(yǎng)物最終可以獲得10mg純度99％以上的具有抑菌活性的重組LfcinB15-W4,10四聚體，