家蠅抗菌肽cecropin基因在原核細胞中的高效融合表達及抑制性消減文庫的構建.pdf

1、家蠅天蠶素(Mdmcec)分子量約為4.0 kDa，由31～39個氨基酸殘基組成，對革蘭氏陰性菌和陽性菌具有較強的抑制作用，對病毒、真菌也有一定的抑制作用，有望發(fā)展為新一代肽類抗生素。本論文以家蠅為實驗材料，以Mdmcec為基礎，對其抗血清的制備、體外高效表達進行了較詳盡的研究，并對家蠅體內的免疫和發(fā)育相關因子進行了差異篩選。 為增強Mdmcec的抗原性，利用同尾酶技術構建了Mdmcec六拷貝首尾串聯的融合表達載體pQEMdmc

2、ec6，并在大腸桿菌M15中得到高效表達，包涵體蛋白經尿素變性后，利用鎳螯和層析純化了串聯體蛋白，純化量為30mg/l。將純化蛋白免疫新西蘭大白兔，成功制備了Mdmcec6串聯體抗血清(命名為： anti-Mdmcec6)。ELISA實驗結果表明抗6His-Mdmcec6的滴度高達1∶12400，抗Mdmcec的效價為1∶5000。Western blot分析表明，制備的抗血清不僅能特異性地識別純化的Mdmcec，而且能特異性地識別家蠅

3、蛋白粗提液中的cecropin。 為了高效表達可溶性的Mdmcec，本研究利用基因工程手段，構建了家蠅抗菌肽cecropin基因與硫氧還蛋白(Trx)融合的表達質粒pTRX-Mdmcec，在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得高效、可溶性表達。融合蛋白經鎳螯和層析一步純化，純化的融合蛋白經腸激酶切割后，釋放出具有殺菌活性的Mdmcec。重組Mdmcec經鎳螯和層析和RP-HPLC得到純化，純化量為111.2 mg/l。Western

4、 blot檢測表明，Mdmcec能被anti-Mdmcec6抗體特異性地識別。電噴物質譜(ESI-MS)分析表明，Mdmcec的分子量為4.0 kDa。圓二色譜(CD)分析其二級結構中不含β-sheet結構，由61﹪a-helix和39﹪的Random組成。液相法測定Mdmcec抑菌活性表明，Mdmcec不僅對革蘭氏陰性菌E. coli K<,12>D<,31>和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus有很

5、強的抑菌活性，而且對一些真菌也有很強的抑制作用，且對鼠血細胞無溶血作用。雜合肽CA-MA(家蠅cecropinA(1-8)和非洲爪蟾magainin2(1-12))具有廣譜的抗菌活性。為了廉價生產家蠅抗菌肽cecropin和CA-MA，本實驗將Mdmcec和CA-MA與家蠅泛素(ubiquitin)融合，構建了能表達天然N末端蛋白的原核表達質粒pQEUBIMdmcec和pQEUBICAMA，并在宿主菌M15中得到高效表達，表達量分別為4

6、7 mg/l和36 mg/l的融合蛋白。 為了給泛素融合蛋白的切割提供高活性的泛素C末端水解酶，并便于純化切割后釋放出的抗菌肽。本實驗將果蠅泛素水解酶(FUCH)插入到畢赤酵母載體pPICZaA，在酵母細胞GS115中高效表達了C端帶有6His純化標簽的FUCH，FUCH經鎳螯和層析得到簡易純化，純化量為19 mg/l。 Tricine-SDS-PAGE和活性測定表明，融合蛋白經FUCH切割后，釋放出具有殺菌活性的抗菌肽

7、Mdmcec和CA-MA，且分子量與預期大小一致。Mdmcec和CA-MA經鎳螯和層析、超濾和RP-HPLC得到進一步的純化后，獲得重組蛋白分別為8.4 mg/l和6.8 mg/l。激光飛行質譜(MADU-TOF-MS)分析表明，MdmceC和CA-MA分子量分別為4032 Da和2559Da。圓二色譜(CD)分析CA-MA二級結構表明，CA-MA在水相中的二級結構不含β-sheet結構，由17.4﹪a-helix和82.6﹪的Rand

8、om組成?；钚詼y定表明重組蛋白對革蘭氏陰性菌、陽性菌和真菌有很強的抑制作用，而且對小鼠血細胞無溶血作用。 為了尋找家蠅免疫調控相關因子和發(fā)育調控基因，本研究以健康家蠅三齡幼蟲為對照群體，以細菌誘導后的三齡幼蟲和蛹為目標群體，構建了抑制性差減文庫(SSH)。對PCR篩選的部分克隆子測序，獲得了359條ESTs。將ESTs進行同源性分析，獲得了143條不同ESTs，可初步分為六類，第一類：13條免疫相關ESTs；第二類：18個轉錄因

9、子相關ESTs；第三類：61條酶類相關的ESTs：第四類：25條受體相關ESTs；第五類：14條ESTs，其中包括發(fā)育相關、細胞調亡相關、細胞骨架和功能未知的ESTs；第六類：家蠅已經在GenBank登錄的12條ESTs。總之，本論文首次成功制備了Mdmcec抗血清，為抗菌肽抗血清的制備提供了新的思路，并為抗菌肽cecropin在蛋白水平上的檢測提供了分子依據；抗菌肽的體外成功的高效融合表達為抗菌肽的功能與結構研究及其應用提供了經濟的表