棉花黃萎病、枯萎病拮抗細菌的篩選及相關抗病基因的克隆.pdf

1、棉花黃萎病、枯萎病是目前最主要的真菌病害之一,給世界棉花產業(yè)造成嚴重的經濟損失,且極難防治.因此篩選拮抗菌、克隆抗病相關基因、研制高效生物農藥具有十分重要的意義.本實驗從士壤中篩選高效拮抗菌株,克隆細菌源棉花黃萎病、枯萎病的抗病相關基因,為構建基因工程拮抗菌、制備微生物農藥提供技術平臺. 從中國農業(yè)科學院植物保護研究所黃萎病、枯萎病發(fā)病較輕的試驗棉田采集根圍土,利用十壤稀釋分離法從中分離出21株細菌.通過平板對峙法,篩選出5株具有自主知

2、識產權的,對棉花黃萎病菌、枯萎病菌皆具有拮抗活性的細菌.這5株拮抗細菌C5,C6,S6,S1,B1的發(fā)酵液對黃萎病菌的抑菌效率分別達到22.6﹪,38.7﹪,53.1﹪,52.4﹪,21﹪;對枯萎病菌的抑菌效率分別達到22.8﹪,38.7﹪,55.2﹪,56﹪,23.5﹪.S6,S1的拮抗活性比較高,具有作為生防菌應用的潛能. 5株拮抗細菌經過革蘭氏染色均為陽性細菌.利用16s rDNA技術,s6被初步鑒定為芽孢桿菌.經過在不同

3、培養(yǎng)條件下對S6 OD<,600>值的測定發(fā)現:s6生長迅速,28℃在LB液體培養(yǎng)基中2h即達到生長對數期,30h后達到生長最高峰.S6在15～50℃范圍內均能生長,最適生長溫度為28℃.在pH值4～9之間均能良好生長,最適pH值為7. S6在Amp、Cm、Ery、Rif、Km等常見抗生素培養(yǎng)基中不能生長,能耐受25μg/mL濃度的Spc、Sm.用細胞壁降解酶平板檢測,發(fā)現S6在果膠酶、幾丁質酶、纖維素酶、葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基平板上均出現

4、顯著水解圈.用 DNS等方法測定,S6分泌的幾丁質酶、葡聚糖酶、果膠酶、纖維素酶的活性分別達到6.04U,24.86U,23.37U,10.37U.同時發(fā)現,S6能向胞外分泌一些揮發(fā)性的拮抗物質. 葡聚糖酶是重要的一類抗菌酶,具有很高的應用價值.根據已知的葡聚糖酶基因序列設計葡聚糖酶特異引物,經PCR擴增獲得-700bp的條帶,經測序及上網比對,該序列與來源于Bacillus cereus E33L葡聚糖酶基因具有很高的相似性,

5、初步認為該片段為葡聚糖酶的部分基因片段.為了進一步獲得拮抗相關基因,利用轉座子pIC333構建s6的插入突變體庫,通過影印培養(yǎng),篩選出3株抗菌活性顯著下降的突變株,經過BOX-PCR驗證后,從突變株中獲得-500bp的序列,將此序列與GenBank中的序列進行比對,發(fā)現該片段與來源于枯草芽孢桿菌的伊枯草桿菌素合成酶 B (iturin A synthetase B)基岡片段相似性高達99﹪,初步認為該序列為伊枯草桿菌素合成酶B基因片段.