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文檔簡介
1、瘦素(leptin)是肥胖基因(ob)的編碼產物,為16 kDa的親水性多肽,在哺乳動物中主要由脂肪組織合成,而在魚類中主要在肝臟產生。成熟的leptin進入血液,在中樞神經系統(tǒng)和外周組織中發(fā)揮作用,參與機體的多種生物學功能,包括攝食調節(jié)、能量平衡、生長、生殖、免疫和骨代謝等。研究表明,leptin必須通過與leptin受體(leptin receptor,LepR)結合,才能發(fā)揮調節(jié)作用。
LepR是一種跨膜受體,屬于Ⅰ類細
2、胞因子受體家族,廣泛分布于動物機體的中樞神經系統(tǒng)及外周組織中,通過mRNA的可變剪接和/或蛋白酶水解作用產生了多種LepR亞型,魚類中最早由Wong等人在海洋青鯔(Oryzias melastigma)中克隆了長型LepR的cDNA序列。截至目前,在魚類中被發(fā)現(xiàn)的LepR大多只有一種,只在大西洋鮭魚、鯽魚、虹鱒魚和羅非魚中克隆出了受體的不同亞型。本實驗室已經從鯽魚中克隆了三種LepR亞型的eDNA序列,分別是長型受體cclpr-L、幾乎
3、不含胞內區(qū)的“無尾”短型受體cclpr-S1、不含跨膜區(qū)的短型受體cclpr-S2(推測編碼可溶性受體)。目前關于魚類可溶性LepR的研究還很少。
本研究從蛋白水平進一步對鯽魚cclpr-S2進行檢測與分析,比較cclpr-S2與leptin-a和leptin-b的結合能力差異;并構建cclpr-S1、cclpr-L的真核熒光蛋白載體,為以后研究cclpr-S1的內化以及cclpr-L與cclpr-S1的異二聚體化等問題打下基
4、礎。
1.通過RT-PCR和RACE技術,擴增獲得leptin-b的完整的編碼區(qū)和3'UTR,系統(tǒng)進化樹分析表明鯽魚leptin-b與建鯉同源性最高,兩者再與草魚匯成一支,最終與斑馬魚匯成一支。
2.為了在蛋白水平上檢測并分析血清中cclpr-S2與leptin-a、leptin-b的結合差異,以進一步了解leptin-a、leptin-b的不同功能。我們首先構建重組表達載體pET32-leptin-b,在25℃、0
5、.1 mM IPTG條件下誘導表達pET32-leptin-a和pET32-leptin-b,并用鎳柱進行純化;提取鯽魚血清進行pull-down實驗,發(fā)現(xiàn)與Trx-leptin-b相比,鯽魚血清中的cclpr-S2更容易被Trx-leptin-a所吸附,說明leptin-a與cclpr-S2的結合能力比leptin-b強,推測leptin-a可能是LepR的主要配體。
3.構建真核熒光蛋白載體 pcDNA3.1-cclpr-
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