鈣離子結(jié)合蛋白基因GhCaM7和GhAnn2在棉花纖維伸長(zhǎng)中的功能分析.pdf

1、棉花纖維的伸長(zhǎng)決定著纖維的質(zhì)量和產(chǎn)量。對(duì)棉花伸長(zhǎng)相關(guān)基因的發(fā)掘和及其分子機(jī)理的研究具有重要意義。雖然利用表達(dá)譜和其他功能基因組手段找到一些對(duì)棉花纖維發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因，但是這些基因在纖維發(fā)育中的作用機(jī)理還很不清楚。在本實(shí)驗(yàn)室涂禮莉老師構(gòu)建的海島棉全生育期纖維cDNA文庫(kù)中，我們找到兩個(gè)在纖維伸長(zhǎng)時(shí)期高豐度表達(dá)的鈣離子結(jié)合蛋白基因GhCaM7（陸地棉鈣調(diào)素7）和GhAnn2（陸地棉膜聯(lián)蛋白2），并通過(guò)轉(zhuǎn)基因、細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)和電生理學(xué)等

2、手段對(duì)這兩個(gè)基因在纖維發(fā)育中的功能做了一定的闡述。具體結(jié)果如下:
　　1、GhCaM7(TC232366)在發(fā)育中的纖維中高量表達(dá)，且其表達(dá)豐度在所有鈣調(diào)素成員中最高。
　　通過(guò)搜索DFCI棉花EST數(shù)據(jù)庫(kù)中找到7個(gè)陸地棉鈣調(diào)素家族成員基因。RT-PCR的結(jié)果顯示有三個(gè)成員TC232366、TC244650和TC256165在纖維中有較高量的表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR發(fā)現(xiàn)TC232366(GhCaM7)在纖維中的表達(dá)豐度

3、較另外兩個(gè)鈣調(diào)素更高。GhCaM7在纖維發(fā)育中的表達(dá)跟纖維頂端鈣離子流入速度趨勢(shì)一致，并且這個(gè)基因在無(wú)纖維突變體胚珠中表達(dá)較正常陸地棉品系低，這些結(jié)果說(shuō)明，GhCaM7可能在纖維發(fā)育中起著重要作用。
　　2、GhCaM7對(duì)早期纖維的發(fā)育有促進(jìn)作用。
　　將GhCaM7在35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行超量表達(dá)和RNA特異干涉。表型鑒定結(jié)果顯示，超量表達(dá)GhCaM7能夠促進(jìn)纖維早期的伸長(zhǎng)而不是后期，而抑制GhCaM7的表達(dá)會(huì)使纖維的突起

4、延遲且纖維的伸長(zhǎng)也會(huì)受到抑制。另外，體外胚珠培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也同樣顯示，胚珠在BT培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天后，GhCaM7超量表達(dá)的纖維明顯長(zhǎng)于野生型，而干涉纖維明顯短于野生型。用鈣調(diào)素的拮抗劑TFP（三氟拉嗪）處理培養(yǎng)中的胚珠，纖維發(fā)育也明顯受到抑制。這些結(jié)果都說(shuō)明GhCaM7對(duì)早期纖維發(fā)育有促進(jìn)作用。
　　3、GhCaM7能通過(guò)調(diào)控ROS的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)纖維早期發(fā)育。
　　通過(guò)外源添加雙氧水和鈣饑餓誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)一定量的活性氧在纖維伸

5、長(zhǎng)中都能起到正調(diào)控的作用。我們通過(guò)活性氧定性和雙氧水定量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了GhCaM7轉(zhuǎn)基因材料纖維和胚珠中的ROS水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GhCaM7超表達(dá)促進(jìn)了ROS的積累，而GhCaM7干涉材料中ROS水平明顯比野生型低。同時(shí)利用胚珠培養(yǎng)體系對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型胚珠進(jìn)行了雙氧水和DPI（活性氧抑制劑）的處理，結(jié)果也表明GhCaM7可能在ROS的上游行使功能。
　　4、ROS對(duì)GhCaM7的表達(dá)也有調(diào)控作用。
　　通過(guò)非損傷微測(cè)技術(shù)和胚珠培

6、養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雙氧水能促進(jìn)鈣離子的內(nèi)流和鈣庫(kù)鈣離子的釋放。qRT-PCR結(jié)果顯示外源雙氧水也能誘導(dǎo)GhCaM7的表達(dá)，這說(shuō)明ROS可以引發(fā)鈣離子的內(nèi)流來(lái)增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，這樣就進(jìn)一步激活GhCaM7的表達(dá)。另外，鈣庫(kù)鈣離子釋放通道抑制劑的處理實(shí)驗(yàn)也顯示鈣饑餓的條件下，ROS的水平受到誘導(dǎo)上升，從而促進(jìn)內(nèi)源鈣庫(kù)的鈣離子的釋放，進(jìn)而上調(diào)GhCaM7的表達(dá)，進(jìn)一步證明ROS可以調(diào)節(jié)GhCaM7的表達(dá)。
　　5、GhCaM7在IAA誘導(dǎo)的

7、纖維伸長(zhǎng)中起著積極作用。
　　qRT-PCR分析結(jié)果表明GhCaM7可以被IAA誘導(dǎo)表達(dá)。隨后利用胚珠培養(yǎng)體系進(jìn)一步考察GhCaM7和IAA的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BT培養(yǎng)基中不加IAA或加入NPA（IAA運(yùn)輸抑制劑）時(shí)，培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系纖維長(zhǎng)度沒(méi)有顯著差別。而當(dāng)BT培養(yǎng)基中加入TFP之后，IAA促進(jìn)纖維伸長(zhǎng)的效果被明顯削弱。由此看來(lái)，GhCaM7在IAA誘導(dǎo)的纖維伸長(zhǎng)中起著積極的作用。而GhCaM7只有在IAA存在的條件下才

8、能更好的在纖維發(fā)育中行使作用。
　　6、GhCaM7與IAA協(xié)同調(diào)控ROS產(chǎn)生
　　5μMIAA處理胚珠能顯著促進(jìn)纖維伸長(zhǎng)，也能誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。而ROS抑制劑能顯著減弱IAA對(duì)纖維伸長(zhǎng)的促進(jìn)效果。這說(shuō)明IAA可能在一定程度上通過(guò)ROS來(lái)影響纖維伸長(zhǎng)。胚珠ROS熒光染色結(jié)果顯示，TFP可以明顯減弱IAA誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生。同時(shí)在IAA存在條件下，GhCaM7水平越高ROS產(chǎn)生越多，而在IAA少量存在或沒(méi)有的條件下，GhCaM

9、7不能更好的促進(jìn)ROS的產(chǎn)生。而減弱鈣調(diào)素作用，IAA同樣也不能很好的產(chǎn)生ROS。這說(shuō)明GhCaM7和IAA協(xié)同調(diào)控ROS的產(chǎn)生。
　　7、GhAnn2在發(fā)育中的纖維中高量表達(dá)，并在纖維伸長(zhǎng)期有表達(dá)高峰。
　　生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GhAnn2可能來(lái)自D基因組。將D基因組所有的膜聯(lián)蛋白基因找出來(lái)并對(duì)他們進(jìn)行RT-PCR和qRT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有7個(gè)膜聯(lián)蛋白基因家族成員在纖維中有表達(dá)，其中GhAnn2在纖維快速伸長(zhǎng)期有表達(dá)高

10、峰。
　　8、GhAnn2下調(diào)表達(dá)抑制纖維伸長(zhǎng)和細(xì)胞壁的合成
　　對(duì)GhAnn2干涉株系進(jìn)行纖維長(zhǎng)度和細(xì)胞壁厚度的考查結(jié)果顯示GhAnn2干涉株系各個(gè)發(fā)育時(shí)期纖維較野生型顯著變短且成熟纖維細(xì)胞壁顯著變薄。qRT-PCR分析表明一些纖維伸長(zhǎng)和次生壁合成相關(guān)基因在干涉纖維中表達(dá)下調(diào)。這說(shuō)明GhAnn2是纖維正常發(fā)育所必需的。
　　9、GhAnn2干涉纖維頂端鈣離子流入減弱
　　非損傷微測(cè)技術(shù)測(cè)定纖維頂端鈣離子流發(fā)現(xiàn)，

11、GhAnn2被干涉后，纖維頂端的鈣離子流呈外流狀態(tài)，而野生型纖維頂端鈣離子呈正常的內(nèi)流狀態(tài)。這說(shuō)明GhAnn2干涉后纖維頂端的鈣離子內(nèi)流減弱。另外用鈣離子通道抑制劑La3+處理離體培養(yǎng)的胚珠發(fā)現(xiàn)GhAnn2干涉的纖維對(duì)La3+更加敏感。由此推測(cè)，GhAnn2的表達(dá)下調(diào)使得纖維頂端鈣離子內(nèi)流減弱導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變小，從而對(duì)鈣離子通道抑制劑更加敏感。
　　10、GhAnn2的抑制表達(dá)擾亂纖維細(xì)胞中鈣離子信號(hào)的傳遞
　　由于G