棉花纖維伸長相關(guān)基因GbEXPA2和GbEXPATR的克隆及功能分析.pdf

1、棉纖維是世界上最重要的天然紡織纖維。它由胚珠外表皮細(xì)胞分化而來，是高度伸長、增厚、無分支的單細(xì)胞表皮毛。成熟棉花纖維的品質(zhì)主要由其細(xì)胞壁的特性所決定，因此對棉花纖維細(xì)胞壁相關(guān)基因的研究，其意義就顯得尤為重要，不僅能豐富現(xiàn)有棉花纖維細(xì)胞壁的研究領(lǐng)域，還能為纖維品質(zhì)的改良提供新的育種材料。本實驗室在前期研究中，比較相同發(fā)育時期海島棉3-79和陸地棉TM-1纖維表達(dá)譜時發(fā)現(xiàn)了一個在海島棉和陸地棉中共同表達(dá)的細(xì)胞壁松弛蛋白基因GbEXPA2和一

2、個海島棉特異表達(dá)的細(xì)胞壁松弛蛋白基因GbEXPATR。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，GbEXPA2具有完整細(xì)胞壁松弛蛋白基因的結(jié)構(gòu)（信號肽和兩個結(jié)構(gòu)域），而GbEXPATR只具有信號肽和第一個結(jié)構(gòu)域，缺少C末端多糖綁定的結(jié)構(gòu)域?；谝陨涎芯?，本論文進(jìn)一步深入分析了這兩個基因的功能。
　　1.海島棉特異表達(dá)的細(xì)胞壁松弛蛋白基因GbEXPATR起源于A基因組
　　通過分析GbEXPA2和GbEXPATR基因的特異SNP位點，發(fā)現(xiàn)GbEXPA2

3、與Gr-contig12和Gh-contig29-2的SNP位點高度相似，GbEXPATR與Ga-contig4和Gh-contig29-1的SNP位點相似，即GbEXPA2來自海島棉的DT亞組，而GbEXPATR來自AT亞組。進(jìn)一步分析表明，在Gh、Ga、Gr中不存在缺失第二個結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞壁松弛蛋白，因此推測GbEXPATR可能是在海島棉多倍體加倍過程中或之后產(chǎn)生的。
　　2.proGbEXPA2和proGbEXPATR是表皮毛

4、特異表達(dá)的啟動子且proGbEXPA2受GA和ABA調(diào)控
　　通過Genome-Walking的方法從海島棉3-79中克隆到長839 bp的GbEXPA2啟動子和長1405 bp的GbEXPATR啟動子。序列比對表明二者具有較高的相似度。分別將proGbEXPA2和proGbEXPATR與GUS報告基因融合轉(zhuǎn)化棉花和擬南芥，組織化學(xué)染色表明這兩個啟動子具有相似的表達(dá)模式，在纖維伸長期和擬南芥表皮毛中高量、優(yōu)勢表達(dá)，在根、莖、葉等其

5、它組織沒有表達(dá)。與proGbEXPATR不同的是，proGbEXPA2在棉花幼嫩葉子的表皮毛中也有表達(dá)。進(jìn)一步通過GbEXPA2啟動子5'端的逐步缺失，發(fā)現(xiàn)長度為461 bp的proGbEXPA2能夠驅(qū)動下游GUS基因在纖維和擬南芥表皮毛中表達(dá)，而長度為258bp則不足以驅(qū)動其表達(dá)，暗示了461bp的啟動子片段是proGbEXPA2的核心啟動子區(qū)域。用GA3和ABA處理proGbEXPA2全長和截短啟動子的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗，GUS染色結(jié)

6、果顯示:proGbEXPA2經(jīng)GA3處理后，GUS表達(dá)量明顯上調(diào);而ABA處理則使GUS表達(dá)量顯著下調(diào)。
　　3.下調(diào)纖維中EXPA的表達(dá)后，纖維變短變粗;而超量表達(dá)GbEXPATR則促進(jìn)纖維變長變細(xì)
　　為了驗證細(xì)胞壁松弛蛋白基因EXPA在纖維發(fā)育中的功能，通過RNAi技術(shù)獲得了EXPA表達(dá)量下調(diào)的五個轉(zhuǎn)基因株系，對其成熟纖維品質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)纖維長度明顯變短、馬克隆值升高、斷裂比強度下降。隨后又檢測了EXPA-RNAi成熟纖維

7、細(xì)胞壁的厚度及晶體纖維素的含量，結(jié)果顯示下調(diào)纖維中EXPA的表達(dá)后，纖維細(xì)胞壁增厚、晶體纖維素含量升高。進(jìn)一步為了研究GbEXPA2和GbEXPATR對纖維發(fā)育的影響，構(gòu)建了它們超量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化陸地棉YZ1，分別獲得3個高量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系。分析表明，超量表達(dá)GbEXPA2不影響纖維細(xì)胞的伸長，但能使其馬克隆值上升、成熟纖維的細(xì)胞壁增厚、晶體纖維素含量升高;而超量表達(dá)GbEXPATR則能促進(jìn)纖維品質(zhì)的提高，使其更長、更細(xì)、更強。通過雜

8、交手段將35S∷GbEXPATR導(dǎo)入到EXPA-3' UTR RNAi植株中，發(fā)現(xiàn)EXPA-3' UTR RNAi短纖維的表型在F1代被完全恢復(fù)，表明在纖維發(fā)育中全長的EXPA能被GbEXPATR功能互補。
　　4.GbEXPATR通過推遲次生壁合成相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而改變細(xì)胞壁成分來促進(jìn)纖維的伸長
　　對EXPA-3' UTR RNAi株系10天纖維的RNA-seq分析表明抑制EXPA的表達(dá)不影響纖維細(xì)胞其它基因的表達(dá)，暗示

9、了EXPA是一類下游基因。qRT-PCR分析其15和20天纖維次生壁相關(guān)基因CTLs、CESAs和GhTLP1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與對照相比沒有一致的變化。在GbEXPA2和GbEXPATR超量表達(dá)株系15天的纖維中，這些次生壁相關(guān)基因被下調(diào)表達(dá);20天，這些基因在GbEXPA2中的表達(dá)變化不明顯，但在GbEXPATR中仍有下降。用單糖關(guān)聯(lián)分析的方法對轉(zhuǎn)基因株系20天纖維細(xì)胞壁成分分析結(jié)果表明，在RNAi和GbEXPA2株系中纖維素含量顯著升高