西瓜ClMYB46基因的耐低溫功能鑒定及調(diào)控作用分析.pdf

1、西瓜（Citrullus lanatus）是重要的葫蘆科作物，具有較高的經(jīng)濟價值。西瓜是典型的喜溫作物，在早春和反季節(jié)設(shè)施栽培過程中，常受到低溫脅迫而影響產(chǎn)量和經(jīng)濟效益。低溫已成為西瓜生產(chǎn)中主要的非生物限制因子，嚴重制約西瓜的周年供應和種植效益提高。MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物應答外界脅迫環(huán)境中起著重要作用，參與調(diào)控下游多個基因的表達。本課題前期研究中，通過挖掘低溫脅迫下西瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)多個基因參與低溫逆境響應。進一步分析得出，Cla0056

2、22的表達量顯著上調(diào)，且屬于MYB-related型轉(zhuǎn)錄因子，但其耐低溫功能及相關(guān)調(diào)控作用尚未明確。為回答上述問題，本研究擬采用如下方法解決:對MYB-related家族成員鑒定、分析Cla005622的結(jié)構(gòu)特征、qRT-PCR鑒定Cla005622對西瓜低溫脅迫的應答、亞細胞定位和轉(zhuǎn)錄活性鑒定Cla005622的特征、超量表達與煙草遺傳轉(zhuǎn)化后鑒定耐低溫性功能驗證、酵母雙雜交探究蛋白互作及功能分析，旨在明確Cla005622對西瓜低溫逆

3、境的耐低溫功能鑒定及調(diào)控作用，結(jié)果不僅可以解析西瓜的低溫耐受性機制，同時還可為后續(xù)從分子育種角度改善西瓜低溫抗性、提高西瓜產(chǎn)量與質(zhì)量提供豐富的基因資源。本文的主要研究結(jié)果如下:
　　1.Cla005622基因結(jié)構(gòu)分析及西瓜MYB-related家族基因成員鑒定。使用NCBI預測Cla005622蛋白保守結(jié)構(gòu)域得知，其屬于典型的MYB-related基因。為進一步探索其在MYB-related家族基因中的特征，通過HMM算法在西瓜全

4、基因組上共鑒定出50個MYB-related家族基因，編碼序列長度240bp-4986bp，等電點4.8-9.97，分子量5890.67-181178.4。據(jù)基因在染色體上的分布順序命名為ClMYB1-ClMYB50。Cla005622對應基因為ClMYB46，編碼序列全長1040bp，編碼334個氨基酸，等電點為6.70，分子量為35890.61，位于第10號染色體。
　　2.ClMYB46對西瓜低溫逆境的應答。以西瓜97103

5、為實驗材料，用qRT-PCR技術(shù)檢測10℃低溫處理西瓜葉片后6h、12h、24h、48h的基因表達量變化，變化趨勢呈現(xiàn)先升高后降低再升高的過程。其中，6h點的表達量達到最高。因此，ClMYB46受低溫脅迫誘導顯著上調(diào)表達。
　　3.ClMYB46的特征分析。亞細胞定位以本氏煙草為實驗材料，構(gòu)建載體GV3101[pH7LIC5.0-N-eGFP-ClMYB46]后瞬時表達，觀測熒光信號位于細胞核。轉(zhuǎn)錄活性鑒定通過構(gòu)建Y2HGold[

6、pGBKT7-ClMYB46]，激活HIS3、ADE2報告基因表達，具有轉(zhuǎn)錄活性。因此，ClMYB46表達部位在細胞核，且具有轉(zhuǎn)錄活性。
　　4.ClMYB46的耐低溫性功能鑒定。以野生栽培煙草為實驗材料，構(gòu)建載體LBA4404[pHellsgate8-ClMYB46]后進行煙草遺傳轉(zhuǎn)化，qRT-PCR檢測ClMYB46表達量，篩選OE1、OE2株系進行后續(xù)實驗。以野生型煙草WT、轉(zhuǎn)基因株系OE1和OE2各75株為實驗材料，4℃低

7、溫處理（光周期16h/8 h，光強100μmol m-2s-1）0h、6h、12h、24h、48h時間點觀察并取樣。表型觀察、冷害指數(shù)測定均得出不同時間點下野生型株系萎蔫程度均高于轉(zhuǎn)基因株系，過表達ClMYB46能提高煙草對低溫逆境的抗性。使用試劑盒測定不同時間點下電導率和丙二醛含量變化得知野生型細胞膜受損傷更嚴重，過表達ClMYB46能提高煙草對低溫逆境的抗性。
　　以低溫處理不同時間點下野生型煙草WT、轉(zhuǎn)基因株系OE1和OE2

8、為材料，qRT-PCR檢測ABA信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)基因（rab18、ABI1、ABI2）與冷脅迫相關(guān)基因(DREB轉(zhuǎn)錄因子DREB2A、脯氨酸合成促進基因P5CS)的表達量變化。ClMYB46上調(diào)引起rab18上調(diào)表達、ABH、ABI2下調(diào)表達、DREB2A、P5CS上調(diào)表達。
　　5.ClMYB46互作蛋白篩選及點對點驗證。重組構(gòu)建無毒性的誘餌載體Y2HGold[pGBKT7-ClMYB46]，AbA抑制其自激活后Mating法篩