STGC3基因轉錄調控元件鑒定及功能位點分析.pdf

1、目的：運用生物信息學預測STGC3基因啟動子，克隆并鑒定STGC3啟動子；在此基礎上，預測STGC3基因轉錄調控元件，分析并證實STGC3基因轉錄調控元件；進一步探討STGC3基因相關轉錄因子對STGC3基因的轉錄調控作用。定點突變STGC3基因結構位點，通過檢測基因突變后對鼻咽癌細胞生物學行為的影響，探討STGC3基因發(fā)揮抑瘤作用的功能性位點，本研究為闡明STGC3基因的結構、功能及轉錄調控機制提供重要的實驗依據(jù)。
　　方法：采

2、用生物信息學預測并分析STGC3基因啟動子區(qū)，克隆最有可能的啟動子，構建雙熒光素酶報告基因質粒，質粒經酶和測序鑒定，經脂質體瞬轉至細胞，通過報告基因表達產物雙熒光素酶活性檢測，以鑒定STGC3基因啟動子區(qū)。
　　在啟動子鑒定基礎上，預測STGC3基因核心啟動子區(qū)轉錄因子特異性結合位點，采用電泳遷移率變動分析法(EMSA)及染色質免疫共沉淀分析(ChIP)法，驗證轉錄因子特異性結合位點，從而明確該基因轉錄調控元件。
　　采用R

3、T-PCR和Western blot檢測STGC3基因高表達的NP69細胞系和STGC3基因低表達的CNE2細胞系中Sp1的表達水平，然后運用RNAi技術干擾細胞中Sp1的表達，通過qRT-PCR和Western blot，分析Sp1低表達后對STGC3基因的影響，以驗證轉錄因子Sp1的轉錄調控作用。
　　針對STGC3基因糖基化位點（656 C）、蛋白激酶C磷酸化位點（725 C）和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(913 T），3個可能

4、性功能位點，運用Stratagene定點突變技術，對STGC3蛋白糖基化位點、蛋白激酶C磷酸化位點及酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點分別進行單堿基定點突變，使656 C突變?yōu)镚，725 C突變?yōu)門，913 T突變?yōu)镚。構建帶His標簽的突變重組真核表達質粒，質粒經轉化、抽提、酶切及測序鑒定，轉染至鼻咽癌CNE2細胞系。通過RT-PCR和Western blot及免疫細胞化學從mRNA和蛋白質水平檢測，得到穩(wěn)定表達突變
　　STGC3基因的C

5、NE2細胞系。通過MTT和胎盼藍染色細胞計數(shù)法檢測STGC3基因突變對CNE2細胞生長增殖影響，采用流式細胞術檢測STGC3基因突變對CNE2細胞周期以及凋亡影響，采用Western blot對凋亡相關蛋白Bax的影響，以明確STGC3基因的抑瘤功能位點。
　　結果：生物信息學結果顯示，STGC3基因5’端上游的－3046bp至－46bp區(qū)域有啟動子活性，在－2992bp至－69bp間啟動子分值達0.8以上，其中－845bp至－7

6、95bp間分值最高，達到1.0。在－1140bp和－774bp處檢測到GC盒信號，在－441bp處檢測到CAAT盒信號。有兩個CpG島：分別在－1805bp至－1705bp和－900bp至－684bp間；有兩個轉錄起始位點：分別在－2348bp和－948bp處。經不同長度的片段缺失比對，取最有可能的283bp（－1360bp至－1077bp）、281bp（－934bp至－653bp）和571bp（－500bp至＋72bp）啟動子片段，構

7、建pGL3-en283、pGL3-en281、pGL3-en571三種質粒，與陰性對照pGL3-enhance質粒相比，三種質粒均具有較強的啟動子活性，三種質粒中以pGL3-en281質粒的啟動子活性最強。認為－934bp至－653bp為STGC3基因核心啟動子區(qū)。
　　生物信息學結果顯示，在STGC3基因核心啟動子區(qū)－934bp至－653bp區(qū)域存在21個轉錄因子結合位點，其中9個為Sp1轉錄因子結合位點；當嚴格限定參數(shù)后，結果

8、顯示，基因核心啟動子區(qū)域含有5個轉錄因子結合位點，其中Sp1轉錄因子結合位點2個。經EMSA和ChIP實驗證實，結果顯示，STGC3基因中存在轉錄因子Sp1特異性結合位點，從而鑒定出STGC3基因轉錄調控元件。
　　RT-PCR技術檢測結果顯示CNE2細胞組(1.12±0.05)中，轉錄因子Sp1在mRNA水平上，表達較NP69細胞組(0.33±0.02)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Western blot結果顯示

9、，CNE2細胞組(2.67±0.28)中轉錄因子Sp1在蛋白水平上，表達高于NP69細胞組(1.17±0.17)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明轉錄因子Sp1有可能負調控STGC3基因。在此基礎上，構建3個Sp1-shRNA干擾質粒，經酶切及測序鑒定，結果顯示，片段大小一致，序列正確，表明成功構建了Sp1干擾載體。Sp1-shRNA干擾載體，經qRT-PCR及western blot篩選。篩選出干擾效率高的Sp1-shRNA載

10、體，轉染至Sp1高表達的CNE2細胞系，qRT-PCR及western blot檢測STGC3基因表達，結果顯示CNE2細胞系中，干擾Sp1表達后，STGC3表達增高。
　　突變質粒經酶切和測序鑒定，酶切結果顯示目的片段大小一致，測序結果顯示序列正確，成功構建三個突變型（His-STGC3-C656G、His-STGC3-C725T和His-STGC3-T913G）真核表達質粒。轉染至鼻咽癌CNE2細胞系，突變質粒經RT-PCR、

11、Western Blot及免疫細胞化學結果顯示，突變質粒均表達STGC3基因mRNA和His-tag-STGC3融合蛋白質， MTT和胎盼藍染色細胞計數(shù)生長曲線結果表明，
　　His-STGC3-C656G和His-STGC3-C725T突變組對細胞的生長增殖抑制能力降低，與野生型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；His-STGC3-T913G突變組不影響細胞生長增殖能力。流式細胞術檢測結果顯示，His-STGC3-C65

12、6G組（1.20％±0.13%）和His-STGC3-C725T組（1.50%±0.26%），細胞凋亡率降低，與His-STGC3組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），三個突變組對細胞生長周期無影響。Western Blot對凋亡相關蛋白Bax檢測，結果顯示，His-STGC3-C656G和
　　His-STGC3-C725T突變組Bax蛋白表達降低，與野生型His-STGC3組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。