ATP13A2(PARK9)基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的鑒定與缺氧調(diào)控.pdf

1、背景：
　　帕金森病(Parkinson's disease,PD)是當(dāng)今僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。PD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,尚未完全明確,目前認(rèn)為可能與老年化、環(huán)境因素(比如MPTP.除草劑、殺蟲(chóng)劑、金屬等)和遺傳因素相關(guān)。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展,遺傳因素在PD發(fā)病機(jī)制中的作用越來(lái)越受到關(guān)注,至少有13個(gè)致病基因被克隆,其中α-synucelein、LRRK2、 PRK

2、IN、DJ-1、PINK1以及ATP13A2作為PD的致病基因已經(jīng)得到了較為一致的肯定。這些基因的功能涉及到了氧化應(yīng)激、線粒體功能缺陷、泛素蛋白酶體系功能障礙等方面。
　　2001年Hampshire等對(duì)一例呈常染色體隱性遺傳的合并有癡呆、核上性凝視麻痹的約旦PD家系進(jìn)行了聯(lián)鎖定位分析,將其致病區(qū)間定位于1p36的一個(gè)9cM的區(qū)域,命名為PARK9。2006年Ramirez等在該家系患者中發(fā)現(xiàn)ATP13A2基因的致病突變,且存在家

3、系共分離,從而克隆了PARK9的致病基因。其后,研究者們對(duì)不同國(guó)家和不同種族來(lái)源的PD患者進(jìn)行了該基因的篩查,不斷有新的病例報(bào)道。ATP13A2基因(OMIM*610513)定位于人類(lèi)染色體1p36,包括三個(gè)剪切本,其編碼的蛋白屬于P型ATPase蛋白超家族,該家族主要參與無(wú)機(jī)離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　近年來(lái),對(duì)于遺傳退行性疾病致病基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控得到越來(lái)越多的重視,轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)對(duì)致病基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)從而參與疾病的發(fā)病機(jī)制,比如轉(zhuǎn)錄因

4、子GATA能夠與SNCA基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,從而使得該基因表達(dá)顯著上調(diào)。目前,轉(zhuǎn)錄因子已成為遺傳退行性疾病治療研究的一個(gè)新興的靶點(diǎn)。盡管ATP13A2作為PD的致病基因已經(jīng)得到了一致的肯定,關(guān)于ATP13A2蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控卻不明確。為了研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)分子機(jī)制,本研究擬對(duì)ATP13A2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)定位并初步分析該基因啟動(dòng)子區(qū)活性特點(diǎn),進(jìn)而研究其啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合情況,深入研究感興趣的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)ATP13A2基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。

5、>　　目的：
　　研究ATP13A2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.運(yùn)用RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA末端快速擴(kuò)增法(RNA ligase mediated rapid amplification of cDNA ends, RLM-RACE)確定人類(lèi)ATP13A2基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site, TSS);
　　2.構(gòu)建連接有不同長(zhǎng)度ATP13A2基因啟動(dòng)子區(qū)

6、序列的重組熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,采用Dual-luciferase reporter assay system對(duì)質(zhì)粒的啟動(dòng)子活性進(jìn)行檢測(cè)；
　　3.運(yùn)用在線軟件結(jié)合手工分析,預(yù)測(cè)ATP13A2基因啟動(dòng)子區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；
　　4.采用凝膠電泳遷移率分析(electrophoretic mobility shift assay, EMS A)以及染色質(zhì)免疫共沉淀分析(chromatin immunopreci-pita

7、tion assay, ChIP)對(duì)預(yù)測(cè)的感興趣的轉(zhuǎn)錄因子缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor1α, HIF-1α)結(jié)合位點(diǎn)—缺氧反應(yīng)元件(hypoxia response element, HRE)進(jìn)行驗(yàn)證；
　　5.運(yùn)用HIF-1α蛋白表達(dá)質(zhì)粒pHA-Hif-1α與含ATP13A2啟動(dòng)子的重組熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pPK9-A共轉(zhuǎn)染或給予pPK9-A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞缺氧處理(2％02),觀察HIF-1α和

8、缺氧對(duì)于ATP13A2基因啟動(dòng)子區(qū)活性的影響；
　　6.給予HEK293細(xì)胞以及小鼠多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞模型MN9D細(xì)胞缺氧處理(2％02),并結(jié)合半定量RT-PCR技術(shù),檢測(cè)兩種細(xì)胞株內(nèi)源性ATP13A2mRNA水平,以進(jìn)一步觀察缺氧對(duì)ATP13A2轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　1.對(duì)RLM-RACE方法獲得的PCR產(chǎn)物測(cè)序顯示與RNA adapter序列相連的第一位堿基為位于ATP13A2翻譯起始位點(diǎn)ATG上

9、游206bp的腺嘌呤A；
　　2.構(gòu)建了一系列連接有ATP13A2基因啟動(dòng)子區(qū)片段的重組pcDNA3質(zhì)粒,命名為pPK9-A至pPK9-J,其中最長(zhǎng)的片段長(zhǎng)度為2.0kb(-1954至+84bp,將TSS定位為+1)；對(duì)這些質(zhì)粒的啟動(dòng)子活性分析表明質(zhì)粒pPK9-A(-1954至+84bp)、pPK9-C(-1538至+84bp)、pPK9-E(-846至+84bp)、pPK9-F(-201至+84bp)、pPK9-G(-78至+8

10、4bp)、pPK9-H(-78至+50bp)具有顯著的啟動(dòng)子活性；
　　3.通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件分析同時(shí)結(jié)合手工比對(duì),結(jié)果顯示在人類(lèi)ATP13A2基因啟動(dòng)子區(qū)-1954至+84bp這-區(qū)間內(nèi)包含有9個(gè)5’-A/GCGTG-3'序列,并依次命名為HRE1至HRE9；
　　4. EMSA結(jié)果顯示HRE-1、HRE-3、HRE-4、HRE-8以及HRE-9的寡居核苷酸能夠顯著的減弱HIF-1α探針與HIF-1α蛋白形成的D

11、NA-蛋白復(fù)合物遷移帶的濃度；ChIP結(jié)果顯示HRE-1、HRE-3+4、HRE-8+9的特異性引物能夠從HIF-1α特異性抗體免疫共沉淀后分離純化的DNA樣品中成功擴(kuò)增出目的片段；
　　5.相對(duì)于空白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照,pPK9-A與質(zhì)粒pHA-Hif-1α共轉(zhuǎn)染顯著增加了pPK9-A的啟動(dòng)子活性(2.483±0.241,p0.05)；相對(duì)于正常氧含量培養(yǎng)的陰性對(duì)照,pPK9-A轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞經(jīng)過(guò)缺氧培養(yǎng)(2％02)顯

12、著增加了pPK9-A的啟動(dòng)子活性(2.466±0.293,p0.05)；
　　6.給予HEK293細(xì)胞缺氧處理(2％02)Oh、12h、24h及48h后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性ATP13A2的RNA水平,結(jié)果在顯示缺氧24h及48h情況下,其mRNA水平顯著增高(分別為2.356±0.320、2.526±0.203,P值均0.05)；給予MN9D細(xì)胞缺氧處理(2％02)Oh、12h、24h后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性Atp13a2mRNA水平,結(jié)果顯示

13、缺氧12h及24h情況下,其RNA水平顯著增高(分別為1.668±0.148、1.606±0.130,P值均0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.人類(lèi)ATP13A2基因的主要轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為位于該基因翻譯起始位點(diǎn)ATG上游206bp的腺嘌呤A；
　　2.ATP13A2基因-78至+50bp的啟動(dòng)子區(qū)域含有ATP13A2基因轉(zhuǎn)錄所必須的核心啟動(dòng)子序列；
　　3. EMSA和ChIP分析證實(shí)ATP13A2基因啟動(dòng)子區(qū)存在功