HGF啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件截短改變與胃癌發(fā)生相關(guān)性研究.pdf

1、胃癌是源自胃粘膜上皮的惡性腫瘤,在我國(guó)發(fā)病率很高,死亡率占惡性腫瘤的第一位。胃癌是多種基因變化參與和積累的結(jié)果,揭示這些基因變化的規(guī)律,不僅可以闡明癌變的機(jī)制,更可以協(xié)助腫瘤的診斷、治療和預(yù)后判斷。
　　 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)主要由間質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生,是一種上皮形態(tài)發(fā)生過(guò)程中的旁分泌調(diào)節(jié)物,具有多種生物學(xué)特性,能刺激多種上皮和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂、運(yùn)動(dòng)以及促

2、進(jìn)腎小管形態(tài)發(fā)生和血管內(nèi)皮再生。HGF生物學(xué)活性由原癌基因c.met編碼的跨膜受體蛋白所介導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)HGF/c-Met通路異?；罨谀[瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。在許多上皮源性腫瘤中常可測(cè)得HGF過(guò)度表達(dá),乳腺癌患者組織和血液中HGF表達(dá)水平顯著高于非乳腺癌患者,出現(xiàn)淋巴結(jié)或肝轉(zhuǎn)移者表達(dá)水平最高,而且HGF和c-Met表達(dá)水平與腫瘤的復(fù)發(fā)有關(guān)。對(duì)HGF異常表達(dá)的人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞系的HGF啟動(dòng)子區(qū)1kb范圍內(nèi)序列突變篩查研究發(fā)現(xiàn),HG

3、F的異位表達(dá)和可誘導(dǎo)表達(dá)的分子基礎(chǔ)是HGF基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游一個(gè)cis作用元件DNA序列的改變。野生型cis作用元件是30個(gè)脫氧腺苷酸(A)形成的PolyA結(jié)構(gòu),將這個(gè)PolyA結(jié)構(gòu)命名為DATE(deoxyadenosine tract element,DATE),當(dāng)DATE發(fā)生截短改變,就會(huì)改變某些轉(zhuǎn)錄因子如C/EBP-β1、PAPP1和PAPP2對(duì)HGF啟動(dòng)子區(qū)DATE及臨近結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合力,增加HGF啟動(dòng)子的活性,促進(jìn)其在腫瘤細(xì)

4、胞中表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性胃癌患者血清HGF顯著高于正常人和原發(fā)性胃癌者,且HGF水平與腫瘤浸潤(rùn)深度及血管受侵程度密切相關(guān),在胃癌中,胃纖維母細(xì)胞通過(guò)激活HGF/c-Met系統(tǒng)來(lái)刺激腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)。胃癌中常可見(jiàn)到c-Met的擴(kuò)增和過(guò)度表達(dá),因此,HGF/c-Met與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。
　　 為探討HGF的DATE截短改變是否與胃癌發(fā)生相關(guān),我們檢測(cè)了胃癌細(xì)胞系和80例胃癌患者HGF啟動(dòng)子區(qū)DATE截短改變情況

5、,并進(jìn)一步用RT-PCR檢測(cè)HGF的DATE發(fā)生截短改變后,HGF相應(yīng)胃癌細(xì)胞系和胃癌組織中的表達(dá),明確二者的相關(guān)性,為胃癌的診斷和治療開(kāi)辟一個(gè)新思路。
　　 材料與方法：
　　 1、胃癌細(xì)胞系、胃癌組織和正常人外周血HGF的DATE截短篩查
　　 常規(guī)酚氯仿法提取胃癌細(xì)胞系、80例胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織和100例正常人外周血基因組DNA,通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增HGF啟動(dòng)子區(qū)DATE序列,產(chǎn)物經(jīng)8％的變性聚丙烯酰胺凝

6、膠電泳檢測(cè),檢測(cè)到DATE截短改變的標(biāo)本進(jìn)行TA克隆測(cè)序驗(yàn)證,HeLa細(xì)胞系DATE的PolyA數(shù)目是30,與正常人基因組DATE序列相同,將HeLa細(xì)胞DATE作為野生型,與野生型DATE相比,胃癌細(xì)胞系、胃癌組織和正常人DATE的PolyA缺失大于等于5A,定義為DATE出現(xiàn)截短改變。
　　 2、RT-PCR檢測(cè)胃癌細(xì)胞系和胃癌組織中腳表達(dá)
　　 5種胃癌細(xì)胞系和30例胃癌組織和相應(yīng)癌旁組織用TRIzol法提取總RN

7、A后,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,RT-PCR檢測(cè)HGF表達(dá),明確DATE截短改變與HGF表達(dá)的關(guān)系。
　　 3、DATE截短改變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的相關(guān)性分析
　　 選取微衛(wèi)星位點(diǎn)D5S396和D5S2056,PCR擴(kuò)增發(fā)生DATE截短改變的6例胃癌組織和相應(yīng)癌旁組織的2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn),比較胃癌組織DATE截短改變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象之間的相關(guān)性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、胃癌細(xì)胞系腳啟動(dòng)子區(qū)DATE截短改變和腳表

8、達(dá)關(guān)系
　　 本研究發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞系MGC803、MKN28和HGC27發(fā)生了DAFE截短改變,基因型分別是30A/25A、25A/25A和27A/25A。胃粘膜上皮細(xì)胞系GES-1和胃癌細(xì)胞系SGC7901、BGC823和AGS DATE沒(méi)有截短改變。
　　 RT-PCR檢測(cè)HGF在胃粘膜上皮細(xì)胞系GES-1及胃癌細(xì)胞系SGC7901、MGC803、BGC823和AGS中表達(dá),發(fā)現(xiàn)HGF只在DATE出現(xiàn)截短改變的MGCS

9、03中表達(dá),DATE沒(méi)有截短改變的細(xì)胞系中沒(méi)有表達(dá),這表明HGF啟動(dòng)子區(qū)DATE的截短改變促進(jìn)了HGF在胃癌細(xì)胞系的表達(dá)。
　　 2、胃癌組織中HGF啟動(dòng)子區(qū)DATE截短改變和HGF表達(dá)關(guān)系
　　 本研究檢測(cè)了80例胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織中HGF啟動(dòng)子區(qū)DATE的截短改變情況。發(fā)現(xiàn)15％(12/80)的胃癌患者存在DATE的截短改變。胃癌組織DATE的PolyA的截短變化范圍從5A～20A。在12例DATE截短改變的胃癌

10、樣本中,7例(58％)DATE截短改變只發(fā)生在胃癌組織,而相應(yīng)癌旁組織DATE沒(méi)有截短改變,其余5例DATE截短改變同時(shí)存在于癌組織和癌旁組織,提示DATE的截短改變與胃癌發(fā)生密切相關(guān)。
　　 RT-PCR檢測(cè)HGF在30例胃癌組織中表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)只在DATE截短改變的6例(占20％)胃癌組織中有HGF表達(dá),而未出現(xiàn)截短改變的胃癌組織和癌旁組織未見(jiàn)HGF表達(dá)。且DATE截短最多的標(biāo)本(其癌組織DATE基因型20A/10A),HG

11、F表達(dá)最高,以上結(jié)果提示HGF表達(dá)水平與DATE截短程度相關(guān)。
　　 3、HGF啟動(dòng)子區(qū)DATE截短改變與胃癌發(fā)生相關(guān)性分析
　　 研究中發(fā)現(xiàn)DATE在相應(yīng)癌旁組織中也出現(xiàn)截短改變,提示DATE的截短改變具有多態(tài)性。分析了100例中國(guó)正常人群外周血中HGF啟動(dòng)子區(qū)DATE截短改變情況,發(fā)現(xiàn)4％(4/100)的人群中出現(xiàn)DATE截短改變。比較胃癌患者和正常人群中DATE截短發(fā)生率,x2檢驗(yàn)顯示兩者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.

12、05),表明DATE截短與胃癌發(fā)生相關(guān)。
　　 4、DATE截短改變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相關(guān)性分析
　　 為了確定DATE在腫瘤組織中的不穩(wěn)定現(xiàn)象和腫瘤組織中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性之間的相關(guān)性,PCR擴(kuò)增已確定DATE截短改變的6例胃癌組織和癌旁組織的D5S396和D5S2056微衛(wèi)星位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)5例在D5S396和D5S2056兩個(gè)位點(diǎn)都出現(xiàn)了微衛(wèi)星不穩(wěn)定性,一例未檢測(cè)到微衛(wèi)星不穩(wěn)定性,這例標(biāo)本癌旁組織和癌組織DATE出現(xiàn)相同程度的

13、截短改變。這表明通過(guò)分析胃癌組織DATE截短改變可以判定胃癌組織發(fā)生了微衛(wèi)星不穩(wěn)定性改變,以上提示HGF啟動(dòng)子區(qū)DATE可作為篩查胃癌組織微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的一個(gè)簡(jiǎn)單而有效的指標(biāo)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)胃癌中存在HGF啟動(dòng)子區(qū)DATE的截短改變,DATE的截短改變能促進(jìn)HGF在胃癌中的表達(dá),表明DATE的截短改變與胃癌發(fā)生密切相關(guān)。
　　 (2)胃癌中DATE的截短改變,能有效判定胃癌組織發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象,