p23基因假定啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控元件的確認(rèn)和研究.pdf

1、新基因p23定位于人染色體1p34.3，編碼由203個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的假定蛋白，已通過(guò)RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)技術(shù)、全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)檢索等技術(shù)確定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。在新基因的結(jié)構(gòu)和功能研究中，分析基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律是其重要研究?jī)?nèi)容之一。為此，我們采用GeneRunner、Proscan和TFsearch等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了p23基因及其變異體的5′調(diào)控區(qū)，對(duì)其假定的近端啟動(dòng)子（距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)約

2、2kb）的核酸序列分析發(fā)現(xiàn)其序列中存在1個(gè)不典型TATAbox（TATAATAAT）、3個(gè)不典型的CAATbox（GGCCCAAT）、7個(gè)GCbox（GGGCGG）、1個(gè)E2F位點(diǎn)（ATCTCGCGCA）、2個(gè)AP1位點(diǎn)（TGASTCAG）和3個(gè)AP4位點(diǎn)（TGCAGCTCGTG）。同時(shí)，通過(guò)分析p23變異體自其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起上游800bp的假定調(diào)控序列，也發(fā)現(xiàn)了1個(gè)不典型的TATAbox、3個(gè)不典型的CAATbox、6個(gè)GCbox、1

3、個(gè)AP1位點(diǎn)、1個(gè)E2F位點(diǎn)和1個(gè)AP4位點(diǎn)。
　　根據(jù)以上生物信息學(xué)分析，本文將根據(jù)p23假定啟動(dòng)子區(qū)域構(gòu)建的截短體和突變體構(gòu)建入pGL3–Basic報(bào)告基因載體。通過(guò)熒光素酶分析比較了一系列重組體的轉(zhuǎn)錄相對(duì)活性，我們發(fā)現(xiàn)p23基因假定近端啟動(dòng)子區(qū)具有轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控功能，尤其是以第二個(gè)CAATbox（–166bp～–169bp）和第三個(gè)CAATbox（–256bp～–259bp）作用顯著，是關(guān)鍵的調(diào)控元件。此外，針對(duì)CAATbox

4、而構(gòu)建的突變體P2m1、P2m2、P2m3的雙熒光素酶相對(duì)活性分析結(jié)果也證實(shí)以上結(jié)論。在針對(duì)p23變異體的系列重組體進(jìn)行的雙報(bào)告基因分析研究中，本研究還發(fā)現(xiàn)p23變異體轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游第二個(gè)CAATbox（–228bp～–233bp）可明顯提高轉(zhuǎn)錄活性，因此它可能和其它CAATbox協(xié)同作用。進(jìn)而應(yīng)用電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA）確定p23基因的近端和遠(yuǎn)端啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子Sp1之間存在相互作用，其確切位置極有可能是近端啟動(dòng)子區(qū)上游172