肝豆?fàn)詈俗冃曰騿幼訁^(qū)的多態(tài)和突變研究.pdf

1、目的： 檢測肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson desease, WD)基因啟動子區(qū)的多態(tài)和突變，從分子水平進一步闡述WD的發(fā)病機制，并豐富WD的基因診斷譜。 方法： 1.實驗對象：2005.11～2005.12檢測28個WD家系70名成員(其中60例WD患者)及10名正常人的基因組DNA啟動子序列，進行分析。 2.PCR擴增：50μl反應(yīng)體積中包含基因組DNA約1600ng，引物各0.5μmol/L，dNTP各

2、200μmol/L，Tris·Cl(PH=8.5)20μmol/L，KCl50mmol/L，MgCl2 2mmol/L，TaqDNA聚合酶（美國Promega公司產(chǎn)品）1.5u。PCR采用熱啟動法，反應(yīng)在美國MJ Reasearch熱循環(huán)儀中進行，擴增條件為：94℃預(yù)變性4分鐘；94℃60秒變性，65℃45秒退火，72℃90秒延伸，共35個循環(huán)；72℃延伸10分鐘結(jié)束反應(yīng)。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，采用DNAMarkerF

3、對照，粗測PCR產(chǎn)物片斷大小。 3. PCR產(chǎn)物自動測序：PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，用基因公司QIAquick Gel Extraction 試劑盒回收擴增片段，采用PE公司的BigdyeTM terminator Cycle Sequencing Reaction 試劑盒及在ABI-3730型自動DNA測序儀上進行測序，具體操作步驟按PE公司介紹的操作指南。 結(jié)果： 1.PCR結(jié)果：PCR擴增出含WD基

4、因啟動子區(qū)、1號外顯子的DNA片段長度約1500bp。 2.將所有正常對照全長啟動子區(qū)的測序結(jié)果輸入計算機，用DNAtools和DNAclub軟件分析得出以下結(jié)果： 2.1.啟動子長度都為1388bp，AT含量為35.4％，GC含量為64.6％。 2.2.存在的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件：①轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合位點：Sp1、Ap1、Ap2、HNF1、HNF3、CTF、NF1、C/EBP；②應(yīng)答元件：4個金屬應(yīng)答元件（MRE）和

5、6個類金屬應(yīng)答元件(MLS,MRE-like sequence)；③順式作用元件：CAATbox、Gcbox、E-box。 2.3.2個12bp的正向重復(fù)順序：GGCACGGCAGAG。 2.4.在正常對照、患者一級親屬和WD患者的啟動子區(qū)-190、-78均發(fā)現(xiàn)存在單個堿基的不同，即多態(tài)；在60例病人中發(fā)現(xiàn)2例存在-782位A→G突變，其中2例為純合突變，另1例為雜合突變；發(fā)現(xiàn)2例存在-504位G→C突變, 其中1例為純

6、合突變,另1例為雜合突變，在正常對照、患者一級親屬中未發(fā)現(xiàn)此改變。 結(jié)論: 1.啟動子區(qū)在調(diào)控WD基因轉(zhuǎn)錄活性中起重要的作用，提示啟動子區(qū)的突變是WD的分子發(fā)病機制之一。但這種突變是否影響啟動子區(qū)的調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能需進一步的研究。 2.本研究發(fā)現(xiàn)的核苷酸多態(tài)位點均位于已知的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)構(gòu)之外，現(xiàn)代分子生物學(xué)研究證實調(diào)控元件之間的序列改變對啟動子的功能沒有影響，故核苷酸多態(tài)對啟動子調(diào)控WD基因的表達不會產(chǎn)生影響

7、。但是多態(tài)位點是否位于尚未知的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件使某種轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白與之結(jié)合受到影響，是否影響啟動子活性的改變，需進一步研究。 3.由于WD基因啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了金屬巰蛋白基因的啟動子序列是一致的的MLS和MRE序列，故MLS和MRE序列很可能是金屬依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合位點，在調(diào)控WD基因轉(zhuǎn)錄活性中有著重要作用。在啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)4個金屬應(yīng)答元件（MRE）和6個類金屬應(yīng)答元件(MLS，MRE-like sequence)，推斷WD基因的轉(zhuǎn)錄

8、可能直接受銅或其它金屬的調(diào)節(jié)。 4.存在的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件： 4.1.轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合位點：Sp1、Ap1、Ap2、HNF1、HNF3、CTF、NF1、C/EBP； 4.2.應(yīng)答元件4個金屬應(yīng)答元件（MRE）和6個類金屬應(yīng)答元件(MLS,MRE-like sequence)； 4.3.順式作用元件：CAATbox、Gcbox、E-box。 上述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件與國內(nèi)外報道一致。 5.由于在啟動