雞NLRC5啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的初步研究.pdf

1、NLRC5是2010年在小鼠上被發(fā)現(xiàn)的新型NOD樣受體分子，是NLR家族最大的成員，免疫組織和器官中高水平表達(dá)，隨后的大量研究表明NLRC5在先天免疫和適應(yīng)性免疫中有重要的作用，但本身的調(diào)控機(jī)制還不清楚，因此為了闡明NLRC5啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控原理，本研究首先檢測(cè)了雞的細(xì)胞系DF1和HD11細(xì)胞中NLRC5的表達(dá)，克隆了NLRC5起始密碼子前4372 bp的啟動(dòng)子區(qū)，構(gòu)建系列啟動(dòng)子區(qū)缺失載體，轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)反映不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子

2、的活性來(lái)尋找核心區(qū)域。預(yù)測(cè)分析啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)可能存在的順式作用元件，接著利用啟動(dòng)子結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子實(shí)驗(yàn)、定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)、EMSA的方法來(lái)驗(yàn)證順式元件及對(duì)NLRC5啟動(dòng)子活性的影響。然后利用軟件預(yù)測(cè)NLRC5啟動(dòng)子區(qū)的CpG島，并通過(guò)BSP檢測(cè)DF1和HD11細(xì)胞的NLRC5啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。最后利用目標(biāo)捕獲測(cè)序的方法對(duì)27個(gè)雞品種NLRC5啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行SNP檢測(cè)，分析SNP對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、甲基化和啟動(dòng)子活性的影響，結(jié)果表明:
　　1

3、.RT-qPCR檢測(cè)到NLRC5在HD11細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于DF1。通過(guò)11個(gè)系列缺失載體的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了NLRC5啟動(dòng)子區(qū)存在2個(gè)核心區(qū)域，分別是-4372到-3756和-2925到-2265，并且NLRC5啟動(dòng)子的活性依賴(lài)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游區(qū)域。
　　2.為尋找NLRC5啟動(dòng)子區(qū)的潛在調(diào)控元件，利用TRANSFAC和JASPAR分析發(fā)現(xiàn)NLRC5啟動(dòng)子-4372到-2065間不包含典型核糖核酸聚合酶Ⅱ結(jié)合元件，第一個(gè)核

4、心區(qū)域內(nèi)存在順式元件YY1，2個(gè)核心區(qū)域和第二個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游分別預(yù)測(cè)到轉(zhuǎn)錄因子STAT家族的結(jié)合位點(diǎn)，而順式元件NFKB只出現(xiàn)在第二個(gè)核心區(qū)域。為了確認(rèn)第二個(gè)核心區(qū)域內(nèi)的順式元件進(jìn)行了啟動(dòng)子結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示此區(qū)域內(nèi)有順式元件STAT1、CEBP，可能存在NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，不含順式元件IRF、PPAR。針對(duì)第二個(gè)核心區(qū)域的順式元件STAT1的點(diǎn)突變和EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了第二個(gè)核心區(qū)域內(nèi)存在順式元件STAT1，并且在NL

5、RC5啟動(dòng)子活性調(diào)控中具有重要作用。
　　3.為探討NLRC5啟動(dòng)子區(qū)的甲基化對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的影響進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，其中MethPrimer預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)2個(gè)CpG島;BSP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DF1處于高甲基化狀態(tài)，而HD11甲基化水平較低，第一個(gè)啟動(dòng)核心區(qū)域及兩個(gè)核心區(qū)域之間有3個(gè)高甲基化區(qū)域(-3989到-3961、-3557到-3430及-3344到-3040)，2個(gè)島內(nèi)含有順式元件E2F、YY1、STAT等。
　　4.最后探討了NL