NLRC5的甲基化修飾對巨噬細胞表型變化的調控作用和部分機制研究.pdf

1、巨噬細胞是先天免疫反應中必不可少的組成成分，它來源于外周血中的單核細胞，當單核細胞從循環(huán)系統(tǒng)中遷移和通過內皮細胞外滲，進一步分化成各種組織駐留的巨噬細胞。類似于Th1/Th2細胞分化，巨噬細胞在不同的微環(huán)境下也可以分化為兩種成熟的表型，通常被稱作M1型和M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞也稱之為經典活化的巨噬細胞，可由干擾素γ（IFN-γ）或與脂多糖（LPS）共同刺激產生，而M2型（即選擇性活化的巨噬細胞）可由各種細胞因子誘導，包括IL-4

2、、IL-13和免疫復合物等。一般來說，M1型活化的巨噬細胞高表達IL-12和IL-23，低表達IL-10;代謝精氨酸，產生高水平的誘導型一氧化氮合酶（iNOS），此外M1型巨噬細胞分泌大量的促炎因子如IL-1β，IL-6和TNF-α等。相反，M2型活化的巨噬細胞高表達IL-10，低表達IL-12和Il-23，并產生精氨酸酶。更重要的是，這兩種表型的巨噬細胞具有復雜的異質性和功能的多樣性，其中許多特征相互矛盾：包括促炎癥活性和抗炎活性，促

3、腫瘤活性和抗腫瘤活性，免疫原性和免疫耐受性，還有組織破壞性和組織修復性。
　　上述的這些表型和功能變化的巨噬細胞對于很多疾病都具有重要作用，例如肝纖維化、腫瘤、肥胖癥等。靶向巨噬細胞表型變化并針對這些疾病的微環(huán)境來相應地改變巨噬細胞的表型可能成為治療疾病的新的希望。
　　但是目前巨噬細胞的表型變化以及潛在的機制尚未明確。NOD樣受體家族是最近被發(fā)現(xiàn)的免疫系統(tǒng)中的一個模式識別受體，已經被證明可以調控炎癥反應和Ⅰ類 MHC轉錄。

4、本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn) NOD樣受體家族的成員之一，NLRC5（由氨基酸的CARD樣區(qū)域、中間的NOD樣區(qū)和羧基端的亮氨酸重復序列區(qū)域三部分組成）對巨噬細胞炎癥因子分泌有著負性調控的作用，也證實了NLRC5對肝纖維化的作用及可能機制（NF-κB信號通路）。根據(jù) NLRC5能夠有效抑制機體的天然免疫和炎癥反應，進一步探索NLRC5是否對巨噬細胞表型變化起到調控作用并探討潛在的機制，本研究主要分為以下幾個部分：
　　1.建立RAW26

5、4.7細胞的M1和M2兩種表型變化模型。
　　選用RAW264.7（小鼠腹腔巨噬細胞株）為研究對象，使用LPS（1000 ng/ml）和IFN-γ（10ng/ml）共同作用12 h誘導巨噬細胞向M1型轉化，而使用IL-4（15 ng/ml）刺激細胞向M2型變化。
　　2. NLRC5在兩種表型變化巨噬細胞中的表達。
　　實驗研究的對象是RAW264.7細胞，分別用RTq-PCR和Western Blot法檢測NLRC5

6、在兩種表型變化的巨噬細胞中mRNA和蛋白的表達。實驗結果可以看出，M1表型的巨噬細胞中NLRC5的表達降低，而M2中NLRC5的表達升高，重復試驗結果經過統(tǒng)計分析，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3. NLRC5的下游調控機制研究。
　　實驗研究的對象是RAW264.7細胞。有文獻報道Notch信號通路在M1型巨噬細胞表型變化中起到重要的作用，本文通過脂質體 LipofectamineTM2000轉染NLRC5 RN

7、Ai和pEGFP-C2-NLRC5后使用倒置熒光顯微鏡觀察轉染效率，Western Blot法檢測NLRC5沉默和過表達后Notch1以及下游蛋白Hes1的表達，結果提示NLRC5調控M1型巨噬細胞轉化可能是由Notch信號通路介導的。
　　4. NLRC5的上游調控機制研究。
　　以RAW264.7細胞為研究對象，RT-qPCR和Western Blot結果顯示在M1型表型變化的巨噬細胞給予甲基化抑制劑（5-azadC）可