SUMO化修飾對胰島β細胞凋亡的調(diào)控及機制研究.pdf

1、一、研究背景
　　近年來,流行病學調(diào)查顯示,世界范圍內(nèi)的糖尿病發(fā)病率由2％上升到5%。特別是在一些發(fā)展中國家,例如中國,經(jīng)濟的迅速發(fā)展伴隨著生活模式和生活環(huán)境的變化,使糖尿病的發(fā)病率每年增長3%。1型糖尿病(type1diabetes,T1D)又名胰島素依賴型糖尿病(IDDM)或青少年糖尿病,是兒童與青少年常見的內(nèi)分泌疾病。1型糖尿病是易感個體在環(huán)境因素的誘導下,由Th1細胞介導,以免疫性胰島炎和胰島β細胞受損為主要特征的自身免疫

2、性疾病。2型糖尿病主要發(fā)生于成人,是由于體內(nèi)高糖高脂毒性對β細胞的長期損害所致,表現(xiàn)為胰島素抵抗和肥胖。外源性胰島素治療不能像自身分泌的內(nèi)源性胰島素那樣精確地調(diào)節(jié)血糖水平,所以,糖尿病患者常伴有多種并發(fā)癥:糖尿病腎病、酮癥酸中毒、非酮癥性高滲性昏迷、糖尿病性心臟病、糖尿病性腦血管病變、糖尿病性肢端壞疽、糖尿病性神經(jīng)病變等。并且,糖尿病病情遷延,難以根除,需長期用藥,導致家庭和社會負擔沉重。我國用于治療糖尿病的醫(yī)療支出約占醫(yī)療衛(wèi)生總費用4

3、%~5%。
　　1型和2型糖尿病的發(fā)病機制至今尚未明確,但大量的研究證實氧化應激(Oxidativestress)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERstress)在β細胞損壞導致糖尿病過程中發(fā)揮重要作用。氧化應激是導致β細胞損傷、凋亡的主要病理基礎。在正常狀態(tài)下機體可產(chǎn)生少量活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS),同時存在自由基清除體系,使自由基的產(chǎn)生和清除保持平衡。少量活性氧自由基參與代謝,如細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導,調(diào)控細

4、胞的生長、分裂、分化、遷移、凋亡及衰老等生理活動,但過多活性氧自由基可導致組織、細胞發(fā)生病理改變,造成的機體傷害。胰腺β細胞抗氧化防御能力低下,細胞內(nèi)自由基清除酶(Cu/Zn超氧化物歧化酶、Mn超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶)和ROS清除蛋白(硫氧化還原蛋白)水平較低,使較低的氧自由基濃度即可使胰腺β細胞受損。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是導致β細胞損傷、凋亡的另一個重要機制。β細胞作為內(nèi)分泌細胞,擁有高度發(fā)達的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng),同

5、時也使β細胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激高度敏感。在氧化應激等情況下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白增多,發(fā)生未折疊蛋白反應(Unfoldproteinresponse,UPR),該反應首先激活膜上的3個信號蛋白:PERK(PKR-likeERkinase,雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶),IRE-1(inositolrequiringenzyme1,跨膜蛋白激酶1)和ATF6(Activatingtranscriptionfactor6,活化轉(zhuǎn)錄因子6),通

6、過其下游信號通路抑制蛋白質(zhì)的合成,上調(diào)分子伴侶和折疊蛋白的表達,加速未折疊蛋白的降解等多種方式緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)。當UPR超過細胞的承受能力,使細胞不能重新回到穩(wěn)態(tài)時,則會啟動細胞凋亡程序。通過CHOP通路、IRE1-TRAF2-ASK1-caspase12通路和Ca2+通路,使細胞發(fā)生凋亡。
　　氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激所致β細胞損傷是引發(fā)及推動1型和2型糖尿病的重要環(huán)節(jié),兩者分別/共同作用,使β細胞失去分泌胰島素的功能。本課題組的

7、前期及其它課題組研究結果顯示,在氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下,SUMO高表達,多種抵抗應激的蛋白被SUMO化,顯示蛋白SUMO化是一種重要的轉(zhuǎn)錄后抵抗應激的調(diào)節(jié)機制。
　　SUMO化修飾過程與泛素化類似,包含E1活化酶,E2結合酶以及E3連接酶三個酶的級聯(lián)反應。E1活化酶是一種異源二聚體,在哺乳動物中為SAE1/SAE2,E2結合酶為UBC9,UBC9是SUMO化修飾中唯一的E2結合酶,UBC9的表達變化直接影響到SUMO化功能,因

8、此,UBC9是研究β細胞SUMO化功能的良好靶點。UBC9基因缺乏會導致小鼠胚胎期死亡。E3酶主要包括三類:PIAS家族、核孔蛋白RanBP2/Nup358和Pc2。通過三種酶的級聯(lián)反應SUMO分子被轉(zhuǎn)移至底物蛋白。
　　本研究以UBC9為靶點,以誘導型條件性UBC9基因敲除小鼠,在成年小鼠β細胞內(nèi)特異性地敲除UBC9基因作為模型,研究SUMO化修飾對β細胞功能的影響,進行了以下工作:
　　二、誘導型UBC9基因敲除小鼠模型

9、的建立
　　本研究用ubc9fl/fl小鼠和他莫昔芬誘導型β細胞特異性RipCreER轉(zhuǎn)基因小鼠進行雜交,建立RipCreER+ubc9fl/fl小鼠。對8周齡RipCreER+ubc9fl/fl小鼠腹腔注射他莫昔芬(50mg/kg/天),每天一次,連續(xù)5天,以注射玉米油溶劑(含10%乙醇)的同窩同性別小鼠作為對照,誘導成年小鼠的β細胞UBC9基因敲除。注射完成5天后處死小鼠,由膽總管向胰腺注入膠原酶P,消化挑揀胰島。提取胰島的D

10、NA和蛋白,進行PCR和Westernblot分析胰島的基因組型別及UBC9的表達,驗證基因敲除效果。結果顯示:對照組小鼠胰島UBC9基因完整,表達UBC9蛋白高,而他莫昔芬組誘導組胰島中染色體UBC9基因部分缺失,未檢出UBC9蛋白表達,表明他莫昔芬誘導后,RipCreER+ubc9fl/fl小鼠UBC9表達缺失;并且雌性小鼠的誘導完全缺失的比率為50%,雄性小鼠的誘導完全缺失的比率為75%。
　　三、UBC9缺失導致小鼠早期發(fā)

11、生糖耐量異常,晚期罹患1型糖尿病
　　1、UBC9基因敲除小鼠早期發(fā)生糖耐量異常
　　(1)UBC9基因敲除小鼠糖耐量降低:他莫昔芬或玉米油注射完畢后第9天(D9)行葡萄糖耐量實驗,實驗前小鼠空腹16小時,腹腔注射2g/kg葡萄糖溶液后于0min、30min、60min、90min、120min和180min采集小鼠尾部血樣檢測各時間點的血糖值。結果顯示:①他莫昔芬組小鼠空腹血糖值較對照油組明顯降低;②對照組小鼠血糖30mi

12、n升到峰值,60min迅速下降,90min基本恢復到正常,而他莫昔芬組小鼠血糖30min峰值明顯升高,60-120min血糖緩慢下降,180min時尚未恢復正常。
　　(2)UBC9基因敲除小鼠胰島素耐受正常:胰島素的分泌減少與胰島素抵抗均可造成糖耐量下降,為了進一步明確他莫昔芬組引起糖耐量下降的原因,我們比較了兩組小鼠的胰島素耐受情況。腹腔注射0.75U/kg胰島素,于注射后0min、15min、30min、45min和60mi

13、n檢測血糖。結果顯示:兩組小鼠0min的隨機血糖值無差異,30min時血糖均降到最低點,60min時血糖基本恢復正常,各時間點組間差異不顯著。
　　以上兩個實驗表明:胰島β細胞特異性UBC9基因缺失導致β細胞分泌胰島素的功能明顯下降,造成糖耐量異常。
　　2、UBC9基因敲除小鼠晚期血糖自發(fā)升高,血清胰島素水平下降,出現(xiàn)自發(fā)糖尿病
　　(1)UBC9基因敲除小鼠平均血糖值升高:監(jiān)測他莫昔芬組和對照組小鼠的隨機血糖值,一

14、周2次。D7到D42天兩組小鼠平均血糖持續(xù)在正常水平,他莫昔芬組血糖略高于對照組,但組間差異不顯著;D42天之后,他莫昔芬組血糖值持續(xù)上升,D70天達478.6±12.4mg/dl,較對照組166.3±6.0mg/dl明顯升高。
　　(2)UBC9基因敲除小鼠血清胰島素水平下降:采集小鼠心臟血液,ELISA檢測血清胰島水平,與對照組相比,他莫昔芬組小鼠血清胰島素水平在D45天之后明顯下降。
　　(3)UBC9基因敲除小鼠糖尿

15、病晚期發(fā)病率100%:他莫昔芬組小鼠在D43天開始出現(xiàn)血糖異常,D55天有66.7%小鼠血糖達到糖尿病標準,D65天所有小鼠均出現(xiàn)血糖異常和糖尿病相關癥狀,而對照組小鼠無1例發(fā)病。
　　以上結果顯示:胰島β細胞特異性UBC9缺失可導致胰島素分泌水平下降,造成血糖升高,長時間血糖升高在晚期造成小鼠罹患糖尿病。
　　四、UBC9缺失導致胰島形態(tài)和功能異常,β細胞發(fā)生凋亡
　　1、胰腺組織內(nèi)胰島團變小,數(shù)目減少:小鼠胰腺石蠟

16、切片HE染色示:對照組胰腺組織胰島團大而圓,胞漿胞核著色均勻;他莫昔芬組胰島團隨著UBC9敲除時間的后移逐漸變小,并出現(xiàn)凋亡小體。胰島素免疫組化染色和免疫熒光染色示:對照組胰島素陽性染色的β細胞團大、圓,占整個切片胰腺組織面積的2%左右;他莫昔芬組胰島素陽性染色細胞團逐漸減小,D45天僅占切片胰腺組織面積的0.9%;D75天減小到0.2%以下。結果顯示:胰島β細胞特異性UBC9缺失導致胰島β細胞形態(tài)異常,數(shù)量減少。
　　2、胰島細

17、胞功能異常:膠原酶P消化獲得胰島,體外培養(yǎng)過夜,進行葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)實驗,檢測胰島在低糖(3.3mM)和高糖(16.7mM)刺激下胰島素的釋放量。他莫昔芬組胰島分泌能力明顯下降。
　　3、胰島內(nèi)β細胞發(fā)生凋亡:TUNEL和cleavedcaspase3染色檢測顯示他莫昔芬組D45天左右胰島內(nèi)2.3%的β細胞發(fā)生凋亡,對照組內(nèi)僅見0.2%的凋亡細胞,組間差異顯著。結果提示:胰島β細胞特異性UBC9缺失使β細胞更容易

18、發(fā)生凋亡。
　　五、UBC9缺失小鼠對STZ誘導糖尿病的耐受力降低
　　他莫昔芬和對照組小鼠腹腔內(nèi)連續(xù)5天注射低劑量STZ(40mg/kg),兩組小鼠隨機血糖值均緩慢上升,他莫昔芬組血糖明顯高于對照組,上升到近600mg/dl,而對照組血糖僅上升到近400mg/dl。結果提示:胰島β細胞特異性UBC9缺失的β細胞對STZ耐受力明顯降低。
　　六、UBC9缺失導致β細胞凋亡的機制
　　1、SUMO-NADPH氧化酶

19、-ROS途徑對β細胞凋亡的影響
　　(1)UBC9基因缺失早期β細胞內(nèi)ROS升高:UBC9基因敲除后D10天,膠原酶消化分離胰島,培養(yǎng)過夜,細胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN-γ)混合刺激6小時,25μM羧基-H2DCFDA中孵育30min,他莫昔芬組胰島內(nèi)ROS熒光強度明顯高于對照組。結果說明:胰島β細胞特異性UBC9缺陷在早期可導致β細胞內(nèi)ROS表達增強。
　　(2)UBC9基因缺失后期β細胞內(nèi)ROS降低:UBC9

20、基因敲除后D30-D45天,胰島培養(yǎng)過夜,細胞因子刺激6小時,H2DCFDA中孵育30min,他莫昔芬組胰島內(nèi)ROS熒光強度明顯低于對照組。結果說明:胰島β細胞特異性UBC9缺陷導致β細胞大量損傷、凋亡,在誘導后期胰島內(nèi)ROS表達減弱。
　　2、Ubc9基因缺陷導致β細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激
　　我們檢測了β細胞內(nèi)ERstress相關蛋白Grp78、Grp58、eIf2a、ATF6、IRE1a和CHOP等蛋白的表達,結果顯示:ERst

21、ress可能介導了β細胞凋亡。
　　七、結論
　　1、UBC9基因缺失早期小鼠發(fā)生糖耐量異常,后期血糖升高,血清胰島素水平下降,基因敲除小鼠全部自發(fā)糖尿病;
　　2、UBC9基因缺陷導致小鼠胰島內(nèi)β細胞凋亡,引發(fā)胰島形態(tài)和功能異常;
　　3、UBC9基因缺陷小鼠對STZ誘導糖尿病的耐受力降低;
　　4、UBC9基因缺陷小鼠β細胞內(nèi)ROS和ERstress的異常表達是導致β細胞損傷、凋亡的重要原因。