PML及PML——NBs調控細胞凋亡機制的研究.pdf

1、細胞內多種機制都執(zhí)行著“寧死勿錯”這一規(guī)則，這就意味著那些基因組受損或失調的細胞將會通過細胞凋亡的方式被剔除，以維持機體的正常功能。一旦細胞凋亡調控出現障礙，細胞自穩(wěn)平衡受到破壞，機體就可能出現諸如腫瘤、自身免疫性疾病、神經退行性病變等疾病，因此細胞凋亡研究一直是生命科學領域的熱點。新近的研究發(fā)現早幼粒細胞白血病蛋白(PML)在多個凋亡信號轉導通路中發(fā)揮著關鍵性的調控作用，PML缺失能夠顯著抑制電離輻射、CD95／Fas、神經酰胺、TN

2、F、IFN等誘發(fā)的細胞凋亡。研究揭示：PML借助N端的RBCC結構自身寡聚化并募集其它蛋白形成其賴以發(fā)揮功能的PML-NBs，一個與核基質相連的、動態(tài)的亞核多蛋白復合物，它作為染色質問區(qū)室(IC)的功能單位，滿足了高層次真核基因表達調控模式的時空要求，參與調控多種重要的細胞學事件。對于PML及PML-NBs在細胞凋亡中的功能作用，Bemardi精辟的概括為：PML及PML-NBs可以作為一種分子接線板選擇性地動態(tài)地調控凋亡相關的轉錄事件

3、，誘導或／和增強細胞凋亡的發(fā)生。 新的研究進展揭示：細胞凋亡調控中特別引人關注的兩個轉錄調控分子p53和Daxx均能夠定位到PML-NBs，并且三者間兩兩相互作用形成了在細胞凋亡調控具有重要功能意義的PML-p53-Daxx轉錄調控網絡，對于這個網絡的研究發(fā)現：p53定位到PML-NBs后發(fā)生特異位點的磷酸化和乙?；?，這些修飾直接促進了p53轉錄激活下游凋亡相關基因進而誘發(fā)細胞凋亡的功能；對于Daxx來說，在PML-NBs中的定

4、位也是其發(fā)揮凋亡調控功能所必須的；而Daxx能夠調控p53的轉錄激活能力，并且這種調控關系同樣受到PML的調控。由此可以看到：PML、p53、Daxx三者間調控關系的研究對于揭示細胞凋亡調控功能具有尤為重要的科學意義。而已有的研究也同時提示：PML對于p53的調控是復雜，除了對修飾的調控可能還存在其它的調控形式；雖然已經證實Daxx可以調控p53的轉錄激活能力，但是對于究竟是抑制還是增強尚無定論?另外，Daxx是否還可以通過其它的途徑，

5、如穩(wěn)定性來調控p537PML又是如何調控Daxx對p53的調控?這些科學問題正是我們所關心的，本研究僅就其中的部分問題進行了探索，并取得了以下的研究進展： 1．檢測了多個腫瘤細胞系中PML的表達，在血液腫瘤細胞系中PML普遍低表達，而實體腫瘤細胞系多表達正常；采用RNAi技術成功構建了穩(wěn)定抑制PML表達的MCF-7細胞模型，為PML功能的研究打下了良好基礎。 2．利用該模型研究發(fā)現PML缺失導致p53與MDM2結合增加，

6、穩(wěn)定性降低，并且在電離輻射造成的DNA損傷反應中p53與PML的結合增加，而和MDM2結合減少，說明PML可能通過與MDM2競爭結合p53而提高p53的穩(wěn)定性；p53反應元件熒光素酶報道載體實驗揭示PML缺失導致p53轉錄激活能力明顯降低，在電離輻射造成的DNA損傷反應中亦是如此；對內源性p53下游基因的檢測顯示，PML缺失導致DNA損傷反應中p53激活促凋亡基因Bax的能力幾乎喪失，誘發(fā)的細胞凋亡能力也受到明顯抑制，lOCyY．射線照

7、射MCF-7細胞，PML干涉細胞發(fā)生凋亡的比例僅為未干涉細胞的60％左右。 3．克隆并構建了PML-IV和p73a、p73p的真核表達載體，并且采用p21啟動子熒光素酶報道載體研究證實PML-IV能夠促進p73a對p21的轉錄激活，PML缺失能夠顯著抑制p73對p2l的轉錄激活，PML缺失細胞中p73激活p21啟動子驅動熒光素酶的表達僅為未干涉細胞中的60％左右。 4．通過對p21、Noxa、survivin啟動子驅動的

8、熒光素酶報道載體的研究證實：Daxx過表達可以抑制p53對周期阻滯基因p2l和促凋亡基因Noxa的轉錄激活，而對p53轉錄抑制survivin沒有影響；Daxx對p53轉錄激活p21的抑制可以被PML-IV所解除；克隆構建了Daxx表達載體，并且得到了穩(wěn)定表達Daxx的細胞模型；研究證實在Hela和MCF-7細胞中過表達Daxx可以增加p53蛋白的表達量；構建了PML-IV和Daxx的可誘導表達的逆轉錄病毒載體，并且成功得到了包裝高滴度

9、(>106)攜帶PML-IV和Daxx基因病毒的PA317細胞株。 5．建立了組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA誘導細胞凋亡的模型，并研究發(fā)現300nM的TSA即可誘導MCF-7細胞凋亡，同時細胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變；PML、p53在TSA誘導后表達量明顯增加，而Daxx變化不明顯，p53下游的MDM2、p21、Bcl-2、survivin表達都呈升高趨勢。 通過對PML-p53-Daxx轉錄調控網絡的研究發(fā)現：PML分子除了可

10、以通過調控p53的翻譯后修飾增加p53轉錄激活下游凋亡相關基因誘導細胞凋亡外，還可以通過增加p53的穩(wěn)定來協同p53誘導細胞凋亡，同時PML也可以增加p53家族另一個成員p73轉錄激活p21的能力；此外同樣定位在PML-NBs中的Daxx可以抑制p53對p2l和Noxa的轉錄激活，而不影響p53對survivin的轉錄抑制，PML-IV可以解除Daxx對p53轉錄激活p21的抑制；研究同時還發(fā)現過表達Daxx可以明顯增加p53蛋白的表達