細(xì)胞內(nèi)源PML-NB相關(guān)蛋白TTRAP的細(xì)胞學(xué)功能初探.pdf

1、鏈霉菌噬菌體PhiC31整合酶介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)是一種相對安全的基因治療方法。為了解其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的整合機(jī)制和可能風(fēng)險(xiǎn)，研究其與細(xì)胞內(nèi)源性蛋白的互作是很有必要的。我們構(gòu)建了pLexA-ΦC31質(zhì)粒用酵母雙雜交的方法篩選人胎腦cDNA文庫并且找到了一個(gè)新的PhiC31互作蛋白TTRAP。通過后續(xù)的酵母配對實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，我們證明TTRAP的N端和PhiC31的C端分別負(fù)責(zé)彼此的結(jié)合。用siRNA knock-down內(nèi)源表達(dá)的TTR

2、AP后，PhiC31整合酶的整合效率得到提高；在外源PhiC31進(jìn)入細(xì)胞后，可以對白介素-1激活的NFκB活性產(chǎn)生明顯的抑制作用，并且這種抑制作用與轉(zhuǎn)染的PhiC31表達(dá)質(zhì)粒量相關(guān)，呈現(xiàn)顯著的劑量效應(yīng)。
　　我們根據(jù)TTRAP的獨(dú)特細(xì)胞學(xué)定位將其鑒定為一種PML-NB核體相關(guān)蛋白。與其他的核體蛋白類似的，TTRAP也與p53存在互作，并且通過酵母配對實(shí)驗(yàn)我們證明了TTRAP結(jié)合在p53的DNA結(jié)合區(qū)域：TTRAP的過量表達(dá)可以顯著

3、提高p53作為轉(zhuǎn)錄因子的活性，這表明TTRAP是與p53相關(guān)的轉(zhuǎn)錄共激活蛋白。
　　最后，我們對TTRAP的細(xì)胞學(xué)功能進(jìn)行了初步的探索。TTRAP的長效表達(dá)可以有效的抑制多種腫瘤細(xì)胞的克隆形成，而TTRAP本身并不會(huì)引起這些細(xì)胞的凋亡或者周期阻滯；我們又構(gòu)建了TTRAP的突變體使其喪失作為磷酸二酯酶的活性，而這些突變體也同時(shí)失去了抑制腫瘤細(xì)胞克隆形成的能力。這些證據(jù)表明，TTRAP的磷酸二酯酶活性對于其保持基因組穩(wěn)定性，抑制腫瘤細(xì)