石刁柏雌雄株間細胞學、內源物質及分子標記研究.pdf

1、石刁柏是世界上廣泛栽培的重要的經濟作物之一，其雄株比雌株高產且有較強的抗病性和生命力，故雄株特別是超雄株倍受生產者的青睞，但由于直到在開花時期，雌雄株在形態(tài)上仍難以區(qū)分，因此利用傳統(tǒng)的方法培育純雄株栽培群體費時費力。同時，石刁柏也是研究植物性別決定機制的模式材料之一，但是由于石刁柏基因組信息缺乏，沒有建立高密度圖譜，限制了石刁柏分子標記輔助育種的應用和基于遺傳圖譜的性別決定基因的克隆和性別決定機制的理解。本研究首先從細胞學確定石刁柏的性

2、別決定方式，在此基礎上分析雌雄性別間的生理代謝差異；利用RAPD、AFLP分子標記技術分析其基因組差異信息，開發(fā)性別鑒定的分子標記，為石刁柏的高效栽培生產服務；同時為石刁柏的性別決定理論機制的研究提供重要的依據(jù)。主要研究結果如下： 1、石刁柏性染色體的細胞學分析。利用常規(guī)細胞學技術對石刁柏核型、花粉母細胞減數(shù)分裂、G-帶及DAPI熒光帶進行了分析，結果表明石刁柏核型公式為2n=2x=20=10m+10sm，核型類型為2B型，屬于

3、較原始的類型。減數(shù)分裂過程中發(fā)現(xiàn)了異型性染色體的分離行為。證明了石刁柏的性染色體為異形染色體，雌株為XX，雄株為XY，且Y染色體是X染色體長度的1.65倍；G帶和DAPI帶顯示其X染色體和Y染色體均富含異染色質。 2、石刁柏雌雄株花分化時期的內源代謝產物差異比較。對石刁柏花分化的營養(yǎng)生長、兩性期、減數(shù)分裂及花成熟期四個時期的內源激素、多胺、氨基酸含量進行比較分析，結果發(fā)現(xiàn)所研究的幾種內源代謝產物均參與了性別的分化過程。雌雄性個體

4、單性性別形成的四個時期中，堿性氨基酸和中性氨基酸在四個時期的總量變化規(guī)律沒有性別的差異。而酸性氨基酸的變化趨勢和雌性性別存在明顯的差異，氨基酸總量在四個時期雄株含量明顯高于雌株。 碳氮化合物含量在雌雄性性別分化過程中均沒有明顯的變化。而C/N比值在雄性性別分化中從營養(yǎng)生長、兩性期到減數(shù)分裂期，C/N比值顯著降低，而到花完全成熟時期又開始回升，而雌性變化不顯著。 IAA在雌雄單性花分化中其含量變化規(guī)律沒有性別差異，GA<,

5、3>、ZRs租ABA含量在花分化過程中含量變化表現(xiàn)出雌雄差異，其差異主要表現(xiàn)在單性花生理分化結束后，說明內源激素并沒參與單性花性別的決定過程。腐胺和亞精胺含量在單性花分化過程中沒有明顯的性別差異；精胺含量在雌雄單性花分化中其含量變化表現(xiàn)出明顯的性別差異，雄性個體在小孢子時期達到最低值，此后又顯著上升。而雌性則相反，隨著雌性性別的分化精胺含量逐漸從最大值開始降低。多胺總量變化也表現(xiàn)出性別差異，多胺總量隨著生殖器官的分化而逐漸升高，到花完全

6、成熟期達到最大值；而在雌株中，多胺總量的最大值出現(xiàn)在兩性期的轉換期，而此后又逐漸降低。 3、利用隨機擴增多態(tài)性DNA技術對石刁柏雌雄株基因組差異進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)，在100個隨機引物中，引物$368在石刁柏基因組中擴增出2條雌性相關的RAPD片斷，它們長度分別為928bp、1178bp，AT含量分別為62％、64％，Genbank檢索未發(fā)現(xiàn)同源片斷。通過設計特異引物將$368928片段成功轉化為穩(wěn)定性更高的SCAR標記。Sou

7、thern雜交表明$368928片段在雌雄基因組中均有雜交信號，屬于是多拷貝的重復序列。通過熒光原位雜交進行染色體定位發(fā)現(xiàn)該標記在雄性中兩對常染色體、X和Y染色體上出現(xiàn)雜交信號，雌性中的雜交信號出現(xiàn)在兩對對常染色體和x染色體上。X、Y染色體以及一對常染色體上的雜交信號出現(xiàn)在著絲粒附近，而另一對常染色體的雜交信號出現(xiàn)在末端。 4、利用限制性片段長度多態(tài)性技術對石刁柏雌雄株基因組差異進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)，在使用的72個引物組合中，引

8、物組合E-AAG+M-CAT從雄性基因組中擴增出了一個555bp的雄性連鎖的片段(MLDA555)，將獲得的差異條帶進行克隆測序發(fā)現(xiàn)該序列長度為555bp，AT含量為59％，經過檢索未發(fā)現(xiàn)同源序列。根據(jù)該片段序列設計的引物將該標記轉化為雄性連鎖的大小為523bp的SCAR標記，經過不同基因型雄性個體的驗證證明該標記廣泛存在于不同基因型石刁柏雄性個體中。Southem雜交僅在雄性基因組中出現(xiàn)低拷貝的雜交信號。熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)，在雄性細胞中