利用AFLP標(biāo)記進(jìn)行榧樹(shù)雌雄株鑒定.pdf

1、利用AFLP標(biāo)記,就榧樹(shù)(Torreya grandis Fort)的雌雄株鑒定開(kāi)展了研究,獲得了以下結(jié)果： 1.首次采用CTAB裂解-硅珠吸咐法,成功提取了榧樹(shù)葉片和胚乳高質(zhì)量的DNA,其OD260/OD280值大多在1.8-2.0之間,且瓊脂糖凝膠電泳條帶明亮、清晰。 2.首次建立了適合榧樹(shù)葉片和胚乳的AFLP實(shí)驗(yàn)體系,為今后榧樹(shù)分子生物學(xué)研究、構(gòu)建遺傳圖譜奠定了基礎(chǔ)。AFLP實(shí)驗(yàn)體系具體如下： 榧樹(shù)DNA酶

2、切連接體系為一步法:DNA為500ng,反應(yīng)體積為25μl,包括Mse I、EcoR I、T4連接酶、M接頭、E接頭、100×BSA、10×NEBuffer2和T4緩沖液。37℃酶切連接過(guò)夜,12h可酶切完全。 預(yù)擴(kuò)增優(yōu)化體系：20μl的反應(yīng)體系含模板DNA,dNTP,Mg2+,Taq聚合酶,Mse I預(yù)擴(kuò)引物和EcoR I預(yù)擴(kuò)引物,緩沖液。PCR程序：94℃變性30s,56℃退火60s,72℃延伸60s,25個(gè)循環(huán)；72℃延伸

3、5 min。 選擇性擴(kuò)增優(yōu)化體系：20gl的反應(yīng)體系中有模板DNA,dNTP,Mg2’,Zaq聚合酶,Mse I選擴(kuò)引物和.EcoR.I選擴(kuò)引物,緩沖液。PCR擴(kuò)增程序：95℃變性30s,65℃退火40s,72℃延伸60 s,13個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.7℃；95℃變性30 s,56℃退火40s,72℃延伸60s,25個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5min。 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,并進(jìn)行銀染。

4、3.從64對(duì)選擇性擴(kuò)增引物中篩選出了適合胚乳AFLP分析的引物組合20對(duì),適合葉片分析的15對(duì),既適合胚乳又適合葉片的引物7對(duì)。 4.利用AFLP分析技術(shù),用引物對(duì)E-AGC/M-CAT得到一條雌性榧樹(shù)特異的條帶。 5.這條榧樹(shù)雌性性別特異性條帶,僅可以對(duì)榧樹(shù)的雌、雄株進(jìn)行鑒別,不能區(qū)分雌株與雌雄同株的個(gè)體,也不能區(qū)分同是雌性的品種香榧與其它自然變異類(lèi)型的榧樹(shù)。 研究結(jié)果可應(yīng)用于生產(chǎn),解決榧樹(shù)章期雌雄株鑒別的問(wèn)題