aflp分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)流程

1、AFLP分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性Amplifiedfragmentlengthpolymphism（AFLP）是在隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)上發(fā)展起來的DNA多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)，具有RFLP技術(shù)高重復(fù)性和RAPD技術(shù)簡(jiǎn)便快捷的特點(diǎn)，不需象RFLP分析一樣必須制備探針，且與RAPD標(biāo)記一樣對(duì)基因組多態(tài)性的檢測(cè)不需要知道其基因組的序列特征，同時(shí)彌補(bǔ)了RAPD技術(shù)重復(fù)性差的缺陷。同其他以PC

2、R為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)相比，AFLP技術(shù)能同時(shí)檢測(cè)到大量的位點(diǎn)和多態(tài)性標(biāo)記。此技術(shù)已經(jīng)成功地用于遺傳多樣性研究，種質(zhì)資源鑒定方面的研究，構(gòu)建遺傳圖譜等。其基本原理是：以PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))為基礎(chǔ)，結(jié)合了RFLP、RAPD的分子標(biāo)記技術(shù)。把DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，然后選擇特定的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增(在所有的限制性片段兩端加上帶有特定序列的“接頭”，用與接頭互補(bǔ)的但3端有幾個(gè)隨機(jī)選擇的核苷酸的引物進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增，只有那些與3端嚴(yán)格配對(duì)

3、的片段才能得到擴(kuò)增)，再在有高分辨力的測(cè)序膠上分開這些擴(kuò)增產(chǎn)物，用放射性法、熒光法或銀染染色法均可檢測(cè)之。一、一、實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料采用青稞葉片提取總DNA。二、二、實(shí)驗(yàn)設(shè)備實(shí)驗(yàn)設(shè)備1.美國貝克曼庫爾特CEQ8000毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，2.美國貝克曼庫爾特臺(tái)式冷凍離心機(jī)，3.美國MJ公司PCR儀，4.安瑪西亞電泳儀等。三、三、實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑1.試劑：請(qǐng)使用高質(zhì)量產(chǎn)品，推薦日本東洋坊TOYOBO公司的相關(guān)產(chǎn)品。DNA提取試劑盒；EcI酶Mse

4、I酶，T4連接酶試劑盒；Taq酶，dNTPPCRreactionbuffer；AFLP引物；瓊脂糖電泳試劑：瓊脂糖，無毒GeneFinder核酸染料替代傳統(tǒng)EB染料；超純水（18.2MΩcm）2其他實(shí)驗(yàn)需要物品微量移液槍（一套）及相應(yīng)尺寸Tip頭PCR管冰浴等。四、四、實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程1、總DNA提取提取使用DNA提取試劑盒提取植物基因組DNA，通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)或用標(biāo)準(zhǔn)品跑膠檢測(cè)。一般來說，100ng的基因組DNA作為反應(yīng)模板是足

5、夠的。2、Ec1酶消化酶消化（20ul體系樣品）Ec11ul(10Uul)10Buffer2ul37℃2hrs65℃30min終止反應(yīng)sample(總DNA)5ulddH2O12ulSample3ul(稀釋10倍)四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析本實(shí)驗(yàn)使用貝克曼庫爾特（BeckmanCoulter）公司CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)，運(yùn)用先進(jìn)的熒光標(biāo)記技術(shù)和毛細(xì)管電泳分離技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率毛細(xì)管中電泳分離，采用激光激發(fā)熒光