柚(citrus grandis Osbeck)單染色體AFLP分子標記體系及文庫的建立.pdf

1、柚是我國重要的水果。柚遺傳背景較復雜，生產(chǎn)周期長，一直以來難以建立精確的物理圖譜，這為進行柚基因組學的研究、分子標記輔助育種以及克隆一些重要的園藝性狀基因造成了困難，染色體微分離弄口微克隆技術的應用為柚類遺傳學的研究提供了新的思路。針對柚單染色體極小，形態(tài)辨別和微分離困難，本試驗采用隨機微分離的方法，通過LA-PCR-AFLP技術對染色體進行同源劃分，并使用Southern雜交技術對單染色體微克隆質(zhì)量和同源劃分的正確性進行鑒定和驗證。最

2、后將各同源單染色體文庫合并，能大大提高同源染色體文庫的覆蓋度，如果將各類同源染色體文庫合并，則建立了整個柚染色體文庫。
　　 1、對柚染色體的制片和微分離技術進行了研究。比較了壓片-液氮速凍揭片法和懸液法制片的優(yōu)劣；優(yōu)化了纖維素果膠酶的濃度比例和酶解時間：2％5f維素酶和1％果膠酶，酶解1 h；比較了卡寶品紅和鐵釩蘇木精兩種染色方法，并最終選用了卡寶品紅染色法；對玻璃針的制備、分離方法進行了選擇和改進。良好的制片效果大大提高了單

3、染色體顯微分離的質(zhì)量和效率。
　　 2、針對柚單染色體微克隆受外源污染干擾嚴重的情況，通過對比試驗，對柚單染色體LA-PCR-AFLP技術體系中外源DNA污染問題中不同試驗用水、加接頭連接前后步驟對水污染的敏感度以及LA-PCR形成的非特異性亮帶現(xiàn)象進行了研究。結(jié)果表明：8種試驗用水中BT水（Bioteke，RNase-free and DNase-freeWater）最佳；水的質(zhì)量對LA-PCR過程中接頭連接之前的步驟影響最大

4、，對加接頭之后的步驟也有一定的影響；非特異性亮帶為引物自連形成的多聚體，與外源污染無關.同時試驗了Southern雜交對柚單染色體LA-PCR過程中外源污染程度的檢測，及細胞質(zhì)污染的影響等。本試驗通過對外源污染的來源和關鍵步驟實施嚴格防控，經(jīng)過dot blot驗證，使外源污染能夠得到有效控制。這為建立高質(zhì)量的柚單染色體文庫奠定了基礎。
　　 3、針對柚葉片多糖的情況，通過3種基因組DNA提取方法比較，最終選用SDS-KAC法并獲

5、得了較高質(zhì)量的柚基因組DNA；對酶切時間和ATP濃度對連接反應的影響進行了研究，證明1-5 h均能滿足單染色體的酶切需要，但是為保證不同單染色體擴增結(jié)果的一致性，最后選擇較長的酶切時間4-5 h；ATP連接終濃度在大于5 mM的時候可能抑制連接反應，而在制接頭的時候不額外添加ATP也不會對實驗結(jié)果造成太大影響；顯微分離了166個柚單染色體，并通過dot-blot雜交和Southern印跡雜交進行了驗證，從中篩選出信號較強的55個單染色體

6、用于進一步試驗。對柚單染色體LA-PCR-AFLP技術體系中的關鍵參數(shù)進行了優(yōu)化，結(jié)果表明：退火溫度較高的程序TD3（退火梯度：72℃→65℃30 s（-0.5℃/cyc））擴增效果較好；稀釋100倍（10 ng）為最適模板量；篩選出了擴增多態(tài)性較好的10組引物對；最終建立了5張不同引物對組合擴增的柚不同單染色體的AFLP-SDS-PAGE指紋圖譜。
　　 4、獲得了高質(zhì)量的官溪蜜柚總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，經(jīng)LA-PC

7、R過程，獲得cDNA擴增產(chǎn)物。獲得的產(chǎn)物經(jīng)純化后與pMD18-T-vector載體連接，進行T-A克隆，獲得大量cDNA文庫片段的克隆子.從其中隨機選擇134個克隆子經(jīng)純化后用于后續(xù)試驗。
　　 5、建立了適用于柚單染色體同源鑒定的dot-blot雜交體系：1）探針制備時DIG-High Prime（vial1）的用量可減少為2.5μL；2）單染色體嚴格純化后制作探針，探針制成后不用再純化；3）使用柚單染色體第一輪LA-PCR產(chǎn)

8、物制作探針效果較好；4）柚單染色體差異片段和柚cDNA擴增文庫片段必須經(jīng)純化后作為模板；5）當使用柚單染色體探針進行dot-blot雜交時，柚單染色體文庫、差異片段、柚cDNA擴增文庫片段模板的上樣量應小于1 ng。
　　 6、對5對引物擴增的AFLP-SDS-PAGE指紋圖譜多態(tài)性片段的聚類分析，初步把55條單染色體體劃分為10類；將這10類染色體分別與134個cDNA擴增文庫克隆子進行dot-blot雜交，驗證了不同單染色體

9、篩選cDNA克隆文庫進行同源性劃分的可行性。通過進一步的Southern雜交驗證，確保了同源劃分的正確性。
　　 本試驗對柚單染色體進行了初步的同源劃分和建立了同源染色體文庫，并經(jīng)過Southern雜交驗證和鑒定。但染色體文庫的完整性和質(zhì)量可能仍然不夠高，需要不斷的進行修彌補和修正。若要建立比較完整和高質(zhì)量的文庫，還要做大量的補充和驗證工作。
　　 單染色體文庫的建立為以后建立柚精確物理圖譜奠定了基礎，對于進一步進行柚基