家蠶染色體雙色FISH技術(shù)體系的建立.pdf

1、家蠶以其品系廣、突變多、繁殖量大等特色漸成為重要的模式生物，對于經(jīng)典遺傳及其他領(lǐng)域的研究具有重要的價(jià)值。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尤其是家蠶基因組的成功繪制，使家蠶研究進(jìn)入基因組及后基因組時(shí)代。由于家蠶染色體具有數(shù)目多、著絲粒彌散化，相互差異不明顯、不易分帶、無固定臂比等自身局限性，限制了家蠶染色體的研究，并阻礙了分子生物學(xué)與經(jīng)典遺傳學(xué)的有機(jī)結(jié)合。家蠶染色體的相關(guān)研究相對集中于染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)特征的觀察、體染色體與性染色的確認(rèn)等初級水平，而基因

2、定位、分子遺傳圖譜構(gòu)建及染色體與基因相互關(guān)系等熱點(diǎn)研究受到很大的限制，需要一種將分子生物學(xué)與經(jīng)典遺傳相連接的技術(shù)，在這種情況下FISH技術(shù)異軍突起。作為能夠?qū)NA分子標(biāo)記直觀定位在染色體上的FISH技術(shù)，與傳統(tǒng)方法相比具有更簡單、更直觀、更快速且準(zhǔn)確的特點(diǎn)。其在家蠶遺傳學(xué)、基因組及后基因組學(xué)研究中，尤其是物理圖譜的研究中起到了重要作用。
　　 對家蠶染色體FISH技術(shù)及雙色FISH技術(shù)體系的成功建立，有利于分子生物學(xué)研究方法向

3、經(jīng)典遺傳研究領(lǐng)域的滲入，有助于家蠶基因定位、基因與染色體相互作用等前沿、熱點(diǎn)問題的研究，使家蠶研究加速進(jìn)入基因組及后基因組時(shí)代，對于家蠶研究具有重要意義。本研究通過雙色FISH技術(shù)對家蠶泛素蛋白連接酶基因(BGIBMGA013548-TA)及絲氨酸蛋白水解酶基因(BGIBMGA010063-TA)進(jìn)行定位，得到了以下研究結(jié)果。1家蠶雙色FISH技術(shù)體系的建立
　　 通過對家蠶雙色FISH條件的優(yōu)化，構(gòu)建出適合家蠶染色體的雙色FI

4、SH技術(shù)體系。家蠶4齡2天的生殖腺染色體更適合FISH實(shí)驗(yàn)；PCR儀進(jìn)行探針變性更為有效；蛋白酶K消化的最佳條件為1μg/ml，37℃孵育5～10 min;共變性對染色體形態(tài)影響十分重要，80℃下2min為宜；37℃下雜交24h即可滿足長度為1000bp的探針的雜交需要；42℃下經(jīng)50％甲酰胺/2×SSC洗滌3次，每次5min即可有效減少“噪音”造成的影；直接將Anti-Dig fluorescence與Cy-3同時(shí)孵育是獲高品質(zhì)雙色F

5、ISH結(jié)果的重要步驟。通過對以上等方面的優(yōu)化改進(jìn)，使用探針DIG-3077、Bio-2983進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)，獲得了清晰、明顯且可信的雙色信號。2對家蠶泛素蛋白連接酶和絲氨酸蛋白水解酶基因的染色體雙色FISH定位
　　 通過家蠶基因組分析，分別在4號染色體的scaf3077、scaf2847及7號染色體的scaf2983、scaf2912上選擇已報(bào)道的家蠶泛素蛋白連接酶基因(BGIBMGA013548-TA)、家蠶mRNA剪接因

6、子(BGIBMGA006022-TA)和絲氨酸蛋白水解酶基因(BGIBMGA010063-TA)、家蠶鈣神經(jīng)連接蛋白基因(BGIBMGA008719-TA)進(jìn)行FISH定位。結(jié)果表明：在生殖腺粗線期染色體上各基因都有單一的雜交信號，表明均為單拷貝基因。單色FISH結(jié)果表明家蠶泛素蛋白連接酶基因、絲氨酸蛋白水解酶基因分別位于不同染色體的端部與中部；通過雙色FISH結(jié)合mRNA剪接因子、家蠶鈣神經(jīng)連接蛋白基因的定位結(jié)果，證明家蠶泛素蛋白連接