蘿卜鎘吸收細胞學機制及相關基因克隆.pdf

1、蘿卜(Raphanus sativus L.)是起源于中國的一種重要十字花科蔬菜作物，是我國重要的蔬菜作物之一，具有較高的食用價值和經(jīng)濟價值。鎘(Cadmium，Cd)是一種毒性很強的環(huán)境污染重金屬之一，土壤的鎘污染不僅嚴重影響農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，還可以通過食物鏈的富集作用危害人體健康。鎘在植物體內(nèi)積累達到一定程度時，就會產(chǎn)生一系列的毒害癥狀。根系是植物最先與土壤環(huán)境接觸的部位，在重金屬脅迫條件下，植物根系在細胞、組織和器官水平上的結構

2、會發(fā)生改變，從而影響植物的一系列的生理活動。隨著長期對環(huán)境的適應與進化，植物產(chǎn)生一系列對鎘的耐性機制，來減輕或者避免鎘的毒害作用。本研究以蘿卜為試材，利用光學顯微鏡和透射電鏡技術研究蘿卜鎘吸收積累細胞學機制;利用同源克隆方法，克隆與鎘轉運積累相關基因并進行相關功能分析;利用mRNA差異顯示技術，進行鎘脅迫下差異表達基因的分離鑒定，為解析植物對鎘的吸收轉運機理提供依據(jù)，得到的主要結果如下:
　　 利用光學顯微鏡和透射電鏡技術進行鎘

3、吸收積累的細胞學機制研究，結果發(fā)現(xiàn)，Cd能引起蘿卜細胞結構的變化，而且隨著Cd濃度的增大，影響越大，破壞越嚴重。透射電鏡下可以觀察到Cd脅迫下蘿卜根部的超微結構變化，在低濃度下，細胞壁先加厚，濃度增大后，出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象，且有斷裂現(xiàn)象;細胞核在低濃度下先是輕微皺縮，高濃度下核仁解體;在低濃度下，線粒體嵴的數(shù)量減少，濃度加大后，線粒體解體，嵴斷裂。低濃度下，Cd在根部主要分布在表皮，濃度加大后，逐漸向內(nèi)部擴展，遍布整個木質(zhì)部，在細胞水平上

4、主要是先分布在細胞壁上，再分布在液泡中。
　　 利用mRNA差異顯示技術，分離得到Cd脅迫下差異表達的36差異片段，其中29條與已知功能基因有較高的同源性，進行功能分類，有逆境相關、光合作用、轉運作用、細胞和組織代謝、轉錄與翻譯表達因子、信號轉導，結果表明蘿卜Cd脅迫是一個多種生理過程共同參與的復雜的過程。
　　 根據(jù)遏藍菜TcZNT2基因的保守序列，搜索蘿卜EST序列，并根據(jù)EST序列設計引物，利用同源克隆方法，克隆得

5、到ZIP家族成員鋅轉運體蛋白RsZNT2，基因組DNA1636bp，包含的1251bp(開放閱讀框)ORF，編碼416個氨基酸，分子量為44.13KDa，含有6個跨膜結構域，經(jīng)過RT-PCR分析顯示，加入Zn后，Cd的表達量減少，可能是Zn與Cd的結構相似，Cd和Zn存在相同的吸收轉運機制，外界Zn濃度的增加降低了Cd的吸收轉運，可能Cd與Zn在一定程度上是通過同一途徑進入植物內(nèi)部的。
　　 利用同源克隆方法，成功克隆得到CDF

6、家族成員金屬轉運體蛋白RsMTP2，基因組DNA1183bp，含1161 bp的ORF，能編碼386個氨基酸。經(jīng)分析，該蛋白含有6個跨膜區(qū)域，是細胞質(zhì)膜上的一個蛋白，與Cd的吸收轉運相關。經(jīng)RT-PCR分析，隨著鎘度的增加，表達量逐漸增加，但在400mg·L-1時，表達量降低，說明鎘濃度的增加誘導RsMTP2的表達，以減輕鎘蘿卜的毒害，但濃度加大到一定程度后，表達量反而降低，說明在轉錄水平上，Cd參與RsMTP2的表達調(diào)控。