蘿卜鎘吸收細(xì)胞學(xué)機(jī)制及相關(guān)基因克隆.pdf

1、蘿卜(Raphanus sativus L.)是起源于中國的一種重要十字花科蔬菜作物，是我國重要的蔬菜作物之一，具有較高的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。鎘(Cadmium，Cd)是一種毒性很強(qiáng)的環(huán)境污染重金屬之一，土壤的鎘污染不僅嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，還可以通過食物鏈的富集作用危害人體健康。鎘在植物體內(nèi)積累達(dá)到一定程度時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生一系列的毒害癥狀。根系是植物最先與土壤環(huán)境接觸的部位，在重金屬脅迫條件下，植物根系在細(xì)胞、組織和器官水平上的結(jié)構(gòu)

2、會(huì)發(fā)生改變，從而影響植物的一系列的生理活動(dòng)。隨著長期對(duì)環(huán)境的適應(yīng)與進(jìn)化，植物產(chǎn)生一系列對(duì)鎘的耐性機(jī)制，來減輕或者避免鎘的毒害作用。本研究以蘿卜為試材，利用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡技術(shù)研究蘿卜鎘吸收積累細(xì)胞學(xué)機(jī)制;利用同源克隆方法，克隆與鎘轉(zhuǎn)運(yùn)積累相關(guān)基因并進(jìn)行相關(guān)功能分析;利用mRNA差異顯示技術(shù)，進(jìn)行鎘脅迫下差異表達(dá)基因的分離鑒定，為解析植物對(duì)鎘的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理提供依據(jù)，得到的主要結(jié)果如下:
　　 利用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡技術(shù)進(jìn)行鎘

3、吸收積累的細(xì)胞學(xué)機(jī)制研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cd能引起蘿卜細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，而且隨著Cd濃度的增大，影響越大，破壞越嚴(yán)重。透射電鏡下可以觀察到Cd脅迫下蘿卜根部的超微結(jié)構(gòu)變化，在低濃度下，細(xì)胞壁先加厚，濃度增大后，出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象，且有斷裂現(xiàn)象;細(xì)胞核在低濃度下先是輕微皺縮，高濃度下核仁解體;在低濃度下，線粒體嵴的數(shù)量減少，濃度加大后，線粒體解體，嵴斷裂。低濃度下，Cd在根部主要分布在表皮，濃度加大后，逐漸向內(nèi)部擴(kuò)展，遍布整個(gè)木質(zhì)部，在細(xì)胞水平上

4、主要是先分布在細(xì)胞壁上，再分布在液泡中。
　　 利用mRNA差異顯示技術(shù)，分離得到Cd脅迫下差異表達(dá)的36差異片段，其中29條與已知功能基因有較高的同源性，進(jìn)行功能分類，有逆境相關(guān)、光合作用、轉(zhuǎn)運(yùn)作用、細(xì)胞和組織代謝、轉(zhuǎn)錄與翻譯表達(dá)因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)果表明蘿卜Cd脅迫是一個(gè)多種生理過程共同參與的復(fù)雜的過程。
　　 根據(jù)遏藍(lán)菜TcZNT2基因的保守序列，搜索蘿卜EST序列，并根據(jù)EST序列設(shè)計(jì)引物，利用同源克隆方法，克隆得

5、到ZIP家族成員鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白R(shí)sZNT2，基因組DNA1636bp，包含的1251bp(開放閱讀框)ORF，編碼416個(gè)氨基酸，分子量為44.13KDa，含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，經(jīng)過RT-PCR分析顯示，加入Zn后，Cd的表達(dá)量減少，可能是Zn與Cd的結(jié)構(gòu)相似，Cd和Zn存在相同的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，外界Zn濃度的增加降低了Cd的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，可能Cd與Zn在一定程度上是通過同一途徑進(jìn)入植物內(nèi)部的。
　　 利用同源克隆方法，成功克隆得到CDF

6、家族成員金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白R(shí)sMTP2，基因組DNA1183bp，含1161 bp的ORF，能編碼386個(gè)氨基酸。經(jīng)分析，該蛋白含有6個(gè)跨膜區(qū)域，是細(xì)胞質(zhì)膜上的一個(gè)蛋白，與Cd的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。經(jīng)RT-PCR分析，隨著鎘度的增加，表達(dá)量逐漸增加，但在400mg·L-1時(shí)，表達(dá)量降低，說明鎘濃度的增加誘導(dǎo)RsMTP2的表達(dá)，以減輕鎘蘿卜的毒害，但濃度加大到一定程度后，表達(dá)量反而降低，說明在轉(zhuǎn)錄水平上，Cd參與RsMTP2的表達(dá)調(diào)控。