中華鱉腎組織的比較細胞學研究及其ACE2的分布與基因克隆.pdf

1、腎臟是脊椎動物最主要的排泄器官,生命活動中產生的代謝廢物和多余的水分,以尿液的形式通過腎臟排出,對調節(jié)機體的水鹽代謝和離子平衡具有重要作用。另一方面,腎臟還具有產生多種激素和生物活性物質的功能。因此,其機能的正常與否直接關系到動物的健康。爬行動物處于動物進化過程中的特殊地位,其腎臟是后腎的開端,屬于脊椎動物腎臟發(fā)育的第五種類型。中華鱉(Pelodiseus sinensis)生活在潮濕的近水源處,機體對水的需求較高,其腎臟在機體保水上發(fā)

2、揮重要作用。為了闡明中華鱉腎組織的細胞學特征,選擇具有明顯耐旱性的雙峰駝(Camelus bactrianus)進行比較研究。與中華鱉棲息地環(huán)境截然相反,雙峰駝生活在干旱的荒漠地區(qū),長期缺水的情況下,仍然能夠生存,這與其腎臟的保水功能有關。腎臟通過減少尿液排泄量達到保水的目的,而如何減少尿液量就顯得尤為重要。
　　 本研究首先從中華鱉腎臟泌尿小管的分布規(guī)律及細胞微細結構入手,深入了解腎臟形態(tài)與其功能的聯系,進一步應用細胞化學反應

3、,探究了四種酶和兩種活性物質在中華鱉腎組織中的分布規(guī)律,在光鏡和電鏡下分析了腎組織微細結構的性別差異。在此基礎上,闡明了血管緊張素轉換酶2(ACE2)在中華鱉腎臟的分布特點,首次克隆并鑒定了爬行動物腎組織ACE2基因,分析并討論了ACE2對腎臟局部腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的作用機制。為了探索中華鱉腎組織的細胞學特性,本文還對生活于干旱環(huán)境的雙峰駝的腎組織進行了比較研究。研究結果在細胞和分子水平上明確了中華鱉腎組織的微細特征和細胞組成

4、及其ACE2的分布與基因克隆,分析了這些特征的機能意義,為中華鱉養(yǎng)殖、保護及資源利用等研究奠定基礎。
　　 試驗Ⅰ中華鱉腎臟的比較組織學研究對中華鱉腎臟進行了詳細的光鏡觀察和結構參數測定及繪制出腎單位分布模式圖,并與雙峰駝腎組織進行了比較。結果表明,中華鱉腎臟由5-6個腎葉組成,腎葉包括被膜和實質兩部分。實質無皮質與髓質之分,而是分為外周區(qū)和中間區(qū),外周區(qū)與中間區(qū)厚度比約為3:1。腎單位無髓袢和球旁復合體結構,但可以區(qū)分為腎小體

5、、頸段(或缺失)、近端小管、中間段、遠端小管和集合管六部分。外周區(qū)主要分布有近端小管、集合管和大部分中間段。中間區(qū)主要分布有腎小體、小部分中間段和大部分遠端小管。鱉腎小體平均直徑約為120μm,在中間區(qū)的小葉內靜脈兩側呈單個分散或2-4個聚集分布。頸段很短或缺失,細胞呈矮立方形,管腔狹窄。近端小管細胞呈柱狀或錐體形,細胞高度約為20μm,胞質嗜酸性,腔面刷狀緣明顯,上皮由弱嗜伊紅的亮細胞和嗜伊紅的暗細胞組成。近端小管外徑為60μm,長度

6、最長,且呈高度盤曲狀。中間段細胞呈矮立方形,細胞高度約為9μm,胞質少,胞核占大部分。中間段外徑為26μm,在與近端小管過渡的部位,胞核呈密集排列,胞質呈弱嗜酸性。遠端小管細胞呈立方形,管徑粗細和細胞大小不一,細胞平均高度約為12μm,平均管徑為37μm,細胞核排列不均勻,胞質弱嗜酸性,其長度僅小于近端小管。集合管管腔最大,外徑為65μm。細胞呈柱狀,高度約為17μm,胞質弱嗜酸性,位于外周區(qū)的近端小管之間,呈稍彎曲狀。小葉內靜脈和動脈

7、分布在中間區(qū)的中央。腎間質少,腎小管之間幾乎全部為毛細血管。中華鱉腎單位的分布規(guī)律和組成與爬行類的蜥蜴、短吻鱷等不完全相同,與哺乳類雙峰駝的差異則更明顯。雙峰駝腎臟實質分為薄的皮質和寬厚的髓質,髓質與皮質厚度比為4:1。腎小體很大,平均直徑約為220μm。長袢型中間腎單位和髓旁腎單位比短袢型淺表腎單位多。皮質迷路內近曲小管遠長于遠曲小管。髓質外髓的直小血管形成發(fā)達的血管束,與泌尿小管束相間排列。內髓比外髓厚,外髓有次級。腎錐體出現。雙峰

8、駝腎臟結構與其具有高濃縮尿液能力相一致。以上結果為爬行類腎單位研究及雙峰駝腎單位結構與尿液濃縮能力的關系研究提供了形態(tài)學資料,同時亦為動物腎臟生理研究提供形態(tài)學依據。
　　 試驗Ⅱ中華鱉腎單位超微結構的比較細胞學研究本試驗利用光鏡、透射電鏡和掃描電鏡對中華鱉腎單位超微結構進行了研究,并與雙峰駝腎組織細胞結構進行了比較。結果表明,中華鱉腎小囊壁層上皮細胞間含有側.基底細胞間隙,并有指狀突起分布。臟層足細胞中含有少量線粒體、豐富的粗

9、面內質網及許多核糖體,這些細胞器一直伴隨突起分布到末端的足突,并可見寬大的足突附著在血管球基底膜上。由足細胞胞體發(fā)出寬大的初級突起,初級突起又發(fā)出多條寬窄不一的次級突起,次級突起再發(fā)出細小而密集的三級突起。這些結構最終形成由一個足細胞的突起伸向幾條毛細血管并通過末端的足突附著于毛細血管基膜上的特殊結構。足細胞的這種形態(tài)在其它脊椎動物腎臟研究中未見報道。血管球基底膜較厚,為300-600nm,內皮孔孔徑約為80-185nm,數量少,且呈區(qū)

10、域性分布。中華鱉腎小球濾過屏障的形態(tài)特征可能與爬行動物具有很低的血管球濾過率相一致。近端小管微絨毛密集而長,頂端胞質含有發(fā)達的胞吞溶酶體結構,為尿液重吸收的主要部位；中間段上皮細胞由多纖毛細胞和非纖毛細胞組成,其主要作用為推送尿液向遠端小管的運輸；遠端小管上皮細胞具有發(fā)達的側指狀鑲嵌內褶和基底質膜內褶,為物質運輸活躍的部位；集合管上皮申的亮細胞的頂端胞質含有許多黏液分泌顆粒,細胞核附近有同心圓形的高爾基體,而在暗細胞中有大量電子密度致密

11、的具板層狀嵴的線粒體。另外,集合管上皮細胞之間含有細胞間隙,間隙內布滿了指狀突起。集合管亮細胞分泌的黏液可以與管腔中的尿酸鹽結合而形成屏障,以阻止細胞內水分進入管腔,起到保水的作用。
　　 與中華鱉腎臟明顯不同,雙峰駝足細胞中含有豐富的線粒體、粗面內質網和高爾基體,且微絲、微管亦發(fā)達。足細胞初級突起寬大,次級突起較短,由次級突起末端形成的足突密集附著于血管球基底膜。近端小管胞質頂端含有豐富的管泡結構,腔面微絨毛粗大、呈高而密集的

12、分布,有些微絨毛頂端形成空泡狀。遠端小管腔面微絨毛短而稀少,胞質內線粒體豐富,質膜內褶發(fā)達。集合小管亮細胞數量多,線粒體少,而暗細胞中線粒體豐富。雙峰駝腎單位的形態(tài)特點與其具有強大的尿液濃縮能力相符。本研究揭示了中華鱉腎單位的微細結構,并與雙峰駝進行了比較,表明中華鱉具有很低的腎小球濾過率,其近端小管在尿液重吸收上發(fā)揮重要作用。中華鱉腎單位細胞結構與其它爬行動物存在一定差異,而與雙峰駝的差異明顯。
　　 試驗Ⅲ中華鱉腎組織微細結

13、構的性別差異利用甲苯胺蘭半薄切片和透射電鏡超薄切片對雌、雄中華鱉腎組織的微細結構進行了比較研究。結果表明,雌、雄中華鱉的近端小管、中間段上皮細胞結構存在一定差異。雄鱉的近端小管細胞之間含有側-基底細胞間隙,側細胞間隙內分布有指狀突起,而細胞基底部與基膜之間形成基底間隙與迷路。雌鱉近端小管上皮無細胞間隙。雌、雄鱉中間段相鄰細胞也表現出相似的形態(tài)差異。側細胞間隙僅存在于雄性中間段上皮,間隙內分布有細長的指狀突起,而在雌性中間段上皮中無細胞間

14、隙。在雄性中華鱉近端小管上皮中含有三種細胞:主細胞、禿頭細胞和基底細胞,與之不同,雌鱉的近端小管上皮則含有亮、暗兩種上皮細胞。
　　 曾有人報道蛇與蜥蜴的腎臟中分布有性段結構,性段為雄性腎單位遠端的膨大部位,其分泌物具有與生殖活動有關的功能。本研究在中華鱉腎臟未觀察到性段結構,但首次發(fā)現雌、雄腎組織的近端小管和中間段的微細結構存在性別差異。這種差異是否與性段具有相似的生物學功能,還需要進一步生理學研究。但雄性近端小管上皮細胞之間

15、存在明顯的間隙應與物質運輸有關,提示,雄性近端小管上皮的重吸收能力可能較雌性強。
　　 試驗Ⅳ中華鱉腎組織的細胞化學特性利用光鏡細胞化學方法對四種酶及兩種活性物質在中華鱉腎單位的分布特性進行了詳細地分析與研究。結果表明,各種酶及活性物質在腎單位中的分布不盡相同,表現出分布部位及反應強弱的不同。琥珀酸脫氫酶(SDH)為細胞內線粒體的標志酶,其主要分布在中間段、遠端小管和集合管上皮細胞中,而在腎小球、近端小管中的反應較弱。堿性磷酸酶

16、(ALPase)存在于物質交換活躍的部位,主要分布在近端小管刷狀緣。ATPase在離子的跨膜轉運及膜電位的調節(jié)方面起著關鍵作用,主要分布在近端小管刷狀緣,而在中間段腔面為弱陽性。酸性磷酸酶(ACPase)作為溶酶體的標志酶,參與胞內磷酸基團的轉移和代謝,其反應在近端小管刷狀緣為強陽性,在腎小球足細胞處呈陽性。集合管胞質內含有大量ACPase陽性顆粒。PAS反應用來鑒定碳水化合物和大分子的糖結合物,在中華鱉腎臟中的分布范圍廣泛,主要分布于

17、腎小球、近端小管、集合管的上皮細胞及所有腎小管的基底膜。集合管腔面顯示PAS強陽性,血管球、遠端小管細胞側面、近端小管刷狀緣為陽性,其它部位反應較弱。阿利新蘭(AB)標記酸性粘蛋白,其主要分布于遠端小管和集合管的腔面。甲苯胺蘭(TB)反應顯示了近端小管、中間段和集合管上皮中的亮、暗細胞。上述細胞化學反應結果表明,腎小球內皮細胞和系膜細胞含有豐富的糖原,為血管球濾過原尿的物質轉運提供能量,而臟層足細胞具有磷酸基團轉運能力；在近端小管上皮組

18、織的原位顯示了幾種與物質轉運有關的活性成分,表明中華鱉近端小管在原尿重吸收中起主要作用；遠端小管和集合管細胞代謝旺盛,細胞腔面分泌的黏液物質可以潤滑管腔,起到保水的作用。中間段代謝活動強,有利于纖毛向后段腎小管推送尿液；研究還表明中華鱉腎小管細胞類型較多。中華鱉腎單位的細胞化學特性不僅與哺乳類和鳥類有一定差異,也與其它爬行動物不完全相同。
　　 試驗V中華鱉腎組織ACE2的免疫細胞化學研究采用免疫細胞化學反應研究了血管緊張素轉換

19、酶2(angiotensin-converting enzyme2,ACE2)在中華鱉腎臟中的分布及特點,并與雙峰駝進行比較。結果首次顯示,ACE2在爬行類腎臟中有分布,進一步證明特異性ACE2陽性反應見于中華鱉腎臟近端小管、足細胞、血管球基底膜和小葉內靜脈內皮,而中間段、遠端小管和集合管上皮弱陽性。ACE2在中華鱉腎單位不同部位的分布表明,其主要在腎小球和近端小管調節(jié)原尿的濾過及重吸收。與之相比,雙峰駝腎臟ACE2在皮質部的分布比髓質

20、部廣泛,皮質部腎小球系膜細胞、近曲小管和集合小管為陽性,而遠曲小管弱陽性。近直小管為陽性,遠直小管弱陽性。髓質部集合小管、乳頭管上皮為陽性,而細段和直小血管為陰性。這些結果表明ACE2在哺乳動物雙峰駝腎臟中的分布比中華鱉更廣泛。ACE2通過調節(jié)腎臟腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS),影響腎臟的血流量,進而調節(jié)水鹽代謝,而廣泛分布的ACE2可能與雙峰駝具有強大的尿液濃縮能力有關。
　　 試驗Ⅵ中華鱉腎臟ACE2基因克隆及其遺傳進化分析

21、本研究從中華鱉腎臟組織中克隆ACE2基因,進一步確定ACE2在中華鱉。腎臟中的存在,為下一步研究其功能提供分子基礎。從中華鱉腎臟中提取總RNA,以Oligo dT-Adaptor為引物合成cDNA。根據人、斑馬魚、雞的ACE2基因mRNA保守序列設計引物,通過聚合酶鏈式反應,擴增出中華鱉ACE2基因的部分序列并進行序列分析。結果顯示:克隆的這段中華鱉ACE2序列長度為355bp,并已將該基因序列提交到GenBank,登錄號為:HM107