中華鱉iNOS基因和COX-2基因的克隆與功能研究.pdf

1、中華鱉（Pelodiscus sinensis）是中國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。近年來(lái)隨著養(yǎng)殖環(huán)境的日益惡化，由病原生物所引起的病害給中華鱉養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，制約中華鱉養(yǎng)殖業(yè)健康快速發(fā)展。然而，目前關(guān)于中華鱉免疫機(jī)制的研究卻仍停留在初步階段。因此研究其免疫機(jī)制將具有較為深遠(yuǎn)的科學(xué)及實(shí)用意義。
　　在本研究中，分別克隆得到了中華鱉誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因(iNOS)和環(huán)氧酶2（COX-2）的編碼區(qū)，并利用

2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了其在中華鱉各組織及接受外源脂多糖(LPS)刺激后的表達(dá)變化情況。此外，還通過(guò)Western blotting和免疫組織化學(xué)技術(shù)研究其在中華鱉小腸、脾臟、腎臟等組織中的表達(dá)及定位情況，由此探明上述兩個(gè)基因在中華鱉抗外源刺激反應(yīng)中所發(fā)揮的作用。主要結(jié)果如下所示:
　　1、iNOS基因的編碼區(qū)包含3444個(gè)堿基，其編碼1147個(gè)氨基酸，軟件預(yù)測(cè)其分子量大小為130kd，等電點(diǎn)為7.72，無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)。

3、熒光定量PCR顯示iNOS基因在心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肌肉、胃、小腸和大腸中均有表達(dá)。其中在大腸中表達(dá)量最高。在受LPS刺激后小腸，肝臟，脾臟，肌肉，腎臟組織當(dāng)中都有明顯的上調(diào)。制作了iNOS蛋白的多克隆抗體，Western blot檢測(cè)腎臟組織中經(jīng)LPS刺激后iNOS含量表現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)。利用免疫組化技術(shù)，發(fā)現(xiàn)iNOS蛋白主要在小腸粘膜層表達(dá)。在脾臟中發(fā)現(xiàn)iNOS蛋白主要在動(dòng)脈周圍和髓小體周圍的一些淋巴細(xì)胞中表達(dá)。
　

4、　2、COX-2基因的開放閱讀框包含1977bp，編碼658個(gè)氨基酸，軟件預(yù)測(cè)其分子量大小為75kd，等電點(diǎn)為8.24，無(wú)信號(hào)肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)域。熒光定量PCR顯示COX-2基因在心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肌肉、胃、小腸、和大腸中均有表達(dá)。其中在大腸中表達(dá)量最高。在受到脂多糖(LPS)刺激后小腸，肝臟，脾臟，肌肉，腎臟組織當(dāng)中都有明顯的上調(diào)。利用免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)COX-2基因主要在小腸絨毛間的結(jié)締組織中表達(dá)，在小腸組織的基底層也有少量的表