棉花分枝GhMAX2基因的克隆與功能研究.pdf

1、棉花是世界上最重要的農(nóng)作物之一,其主副產(chǎn)品都有很高的利用價(jià)值。它既是最重要的纖維作物,又是重要的油料作物,也是含高蛋白的糧食作物,并且還是紡織、精細(xì)化工的原料和重要的戰(zhàn)略物資。但是,棉花自身具有由果枝、營(yíng)養(yǎng)枝和贅芽組成的復(fù)雜的分枝模式和頂芽無限生長(zhǎng)的生長(zhǎng)習(xí)性,導(dǎo)致必須對(duì)其進(jìn)行一定程度的整枝和打頂,耗費(fèi)了大量的勞動(dòng)力。因此,研究棉花分枝控制有著非常重要的意義。
　　本課題主要在實(shí)驗(yàn)室已有基礎(chǔ)上,對(duì)GhMAX2棉花分枝相關(guān)的基因做了進(jìn)

2、一步的研究。
　　GhMAX2基因隸屬F-box/LRR蛋白家族,與水稻的D3基因、豌豆的RMS4基因以及擬南芥的MAX2基因同源性最高。這類基因參與了植物激素獨(dú)角金內(nèi)酯(Strigolactone)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,該激素在植物根部合成,向上運(yùn)輸,抑制地上部分側(cè)枝的伸長(zhǎng)。GhMAX2基因組DNA序列總長(zhǎng)2463bp,5’UTR區(qū)長(zhǎng)為56bp,3’UTR區(qū)長(zhǎng)為298bp,開放閱讀框長(zhǎng)度為2109bp核苷酸,編碼702個(gè)氨基酸,無內(nèi)含

3、子。通過對(duì)GhMAX2序列的克隆,我們獲得了兩條高度同源的序列,它們之間存在31bp不同的堿基序列和15個(gè)不同的氨基酸序列,我們分別命名為GhMAX2a和GhMAX2b。將GhMAX2a/b與其它功能特征相似的蛋白進(jìn)行氨基酸序列分析,如水稻的D3、豌豆的RMS4以及擬南芥的MAX2,發(fā)現(xiàn)在GhMAX2a/b的N端和C端分別存在F-box蛋白域和 LRRs蛋白域。為了研究預(yù)測(cè) MAX2蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系,選取了一些低等植物、單子葉植物、雙

4、子葉植物中相關(guān)蛋白質(zhì)做進(jìn)化樹分析,結(jié)果表明GhMAX2a/b與蓖麻的遺傳距離最近,這表明我們從陸地棉中克隆出了MAX2的同源基因。為了進(jìn)一步研究該基因?qū)χ参锓种Φ恼{(diào)控功能,構(gòu)建CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體GhMAX2CDSa/b-121,轉(zhuǎn)化擬南芥max2突變體。通過對(duì)擬南芥轉(zhuǎn)化結(jié)果的數(shù)據(jù)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化GhMAX2CDSa/b-121載體的突變體表型介于野生型和突變體之間,得到了部分回補(bǔ)。通過此結(jié)果說明GhMAX2基因與擬南芥

5、MAX2基因在功能上是一樣的,即在調(diào)控植物分枝方面起著重要的作用。同時(shí)為了驗(yàn)證同源基因 GhMAX2CDSa和GhMAX2CDSb的表達(dá)水平是否相同,構(gòu)建了pGADT7-GhMAX2a/b載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明GhMAX2b的表達(dá)水平大約是GhMAX2a的3倍。為了驗(yàn)證GhMAX2是否與MAX2/RMS4/D3一樣處在獨(dú)腳金內(nèi)酯的傳導(dǎo)途徑上,通過用不同濃度的GR24處理棉花的幼苗并處理不同的時(shí)間,然后通過在轉(zhuǎn)錄水平上通

6、過RT-PCR來檢測(cè)GhMAX2的表達(dá)水平,結(jié)果表明無論用多高濃度或者低濃度的GR24處理,還是長(zhǎng)時(shí)間處理或者短時(shí)間處理,GhMAX2的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯的變化,即GhMAX2對(duì)GR24是不響應(yīng)的。構(gòu)建了pGADT7-GhMAX2、pGADT7-F-box、pGADT7-LRRs和 pGBKT7-ASK1進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),構(gòu)建了Flag-GhMAX2、Myc-ASK1和Myc-OSK15進(jìn)行免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn),共同驗(yàn)證GhMA