棉花(Gossypium hirsutum)RAV1基因克隆鑒定及功能研究.pdf

1、高鹽和干旱等非生物脅迫是影響植物生長發(fā)育的重要限制因素。因此，通過各種生物學(xué)技術(shù)手段研究農(nóng)作物在脅迫條件下的生長和調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而提高農(nóng)業(yè)效益，具有重要理論意義和應(yīng)用價值。棉花（Gossypium hirsutum）是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)生的棉纖維和棉籽油與人們的日常生活密切相關(guān)，但是，由于我國大面積存在的鹽堿地及許多地區(qū)經(jīng)常性干旱等惡劣氣候條件等各種因素的影響，限制了我國的棉花生產(chǎn)，甚至導(dǎo)致棉花減產(chǎn)減收。目前，關(guān)于棉花脅迫應(yīng)答和A

2、BA信號調(diào)控機(jī)制方面的報道較少，有必要進(jìn)一步探討，提供較為詳細(xì)的科學(xué)資料，應(yīng)用于棉花抗逆育種研究。
　　RAV類蛋白是AP2蛋白家族的一個亞類，在植物脅迫應(yīng)答及激素應(yīng)答方面起關(guān)鍵的調(diào)控作用。AP2家族根據(jù)所含結(jié)構(gòu)域的數(shù)目，可分為AP2亞家族（包含兩個AP2結(jié)構(gòu)域），和EREBP家族（包含一個AP2結(jié)構(gòu)域）。植物RAV蛋白含有一個植物所特有的AP2和一個B3結(jié)構(gòu)域，屬于EREBP家族。我們從棉花cDNA文庫中分離得到一個編碼RAV類

3、蛋白的基因(cDNA)，命名為GhRAV1。初步研究表明，GhRAV1蛋白和其他RAV類蛋白一樣，具有保守的結(jié)構(gòu)域，含有AP2和B3結(jié)構(gòu)域，同時具備核定位特性。該基因在棉花營養(yǎng)組織中表達(dá)量較高，且受干旱、高鹽和ABA的誘導(dǎo)。同時，該基因的表達(dá)受外源的BL影響，可能與BR信號相關(guān)。本文主要在基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式、轉(zhuǎn)錄激活活性、蛋白亞細(xì)胞定位、脅迫應(yīng)答以及與BR信號相關(guān)性等方面來研究和闡述GhRAV1的功能，取得如下研究結(jié)果:

4、　　1.GhRAV1基因的分離鑒定與進(jìn)化分析從棉花cDNA文庫中分離鑒定了1個編碼RAV類蛋白的基因，命名為GhRAV1。GhRAV1含有1074bp的開放閱讀框（ORF），編碼一個由358個氨基酸組成的分子量為37.8kD的蛋白。GhRAV1蛋白結(jié)構(gòu)包括一個AP2結(jié)構(gòu)域和一個B3結(jié)構(gòu)域，屬于RAV亞家族成員。進(jìn)化分析表明，GhRAV1蛋白與煙草NtRAV蛋白、擬南芥AtRAV2、川椒CaRAV1同源性較高，親緣關(guān)系較近。
　　2

5、.GhRAV1基因受ABA、NaCl和PEG誘導(dǎo)表達(dá)熒光定量RT-PCR分析表明，GhRAV1基因在棉花不同組織中均有表達(dá)，在根、子葉、真葉和開花后9天(9 DPA)的纖維中表達(dá)量較高，而在下胚軸、花藥、花瓣、胚珠，以及0-6DPA、12-18DPA纖維細(xì)胞中表達(dá)量較低，這說明該基因在棉花組織中呈現(xiàn)組成型表達(dá)特點(diǎn)。
　　分別用脫落酸(ABA)、NaCl和聚乙二醇(PEG)處理棉花幼苗5天，然后提取棉花不同組織的總RNA，通過實(shí)時熒

6、光定量RT-PCR分析GhRAV1基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，GhRAV1在ABA、NaCl和PEG處理?xiàng)l件下被誘導(dǎo)表達(dá)。與對照相比，處理后的基因表達(dá)量顯著上升。
　　3.GhRAV1蛋白轉(zhuǎn)錄自激活和亞細(xì)胞定位分析構(gòu)建GhRAV1基因表達(dá)載體pGBKT7-RAV1，轉(zhuǎn)化酵母AH109和Y187菌株，研究該蛋白是否具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。研究結(jié)果顯示，GhRAV1蛋白不具備轉(zhuǎn)錄自激活活性。
　　以eGFP為報告基因，構(gòu)建pBI-Gh

7、RAV1-eGFP融合表達(dá)載體，用注射法轉(zhuǎn)化煙草葉表皮細(xì)胞，共培養(yǎng)48小時后，在共聚焦顯微鏡下觀察煙草葉表皮細(xì)胞的綠色熒光，結(jié)果顯示，GFP熒光主要分布在細(xì)胞核內(nèi)。這表明GhRAV1蛋白定位于細(xì)胞核。
　　4.GhRAV1過量表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱和高鹽脅迫的敏感性增加為研究GhRAV1蛋白在植物中的功能，通過構(gòu)建pMD-GhRAV1過量表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥后，對其進(jìn)行抗性分析。植物的脅迫應(yīng)答可能通過依賴ABA和不依賴ABA兩

8、種途徑。因此，我們選用ABA、NaCl和PEG處理轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗，進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GhRAV1過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對鹽和干旱的敏感性增強(qiáng)，而且，與植株對ABA敏感性一致，因而推測GhRAV1可能是通過依賴ABA途徑來參與轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對干旱和高鹽脅迫的應(yīng)答過程。
　　我們通過定量RT-PCR分析了脅迫相關(guān)基因在GhRAV1轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)情況，結(jié)果表明RAB18，RD29B，ABI1，ERD15，KIN1在轉(zhuǎn)

9、基因擬南芥中表達(dá)上調(diào)，而Cor15a8，RD29A，RCI表達(dá)下調(diào)，推測GhRAV1可能通過調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)變化來影響轉(zhuǎn)基因植株對干旱和鹽脅迫的耐性。
　　5.GhRAV1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥對BR信號的應(yīng)答對GhRAV1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗進(jìn)行外源BL處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在BL處理?xiàng)l件下，GhRAV1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥根伸長快于野生型，由此推測GhRAV1可能也參與BR信號通路。
　　6.轉(zhuǎn)基因棉花植株的獲得及初步分析

10、鑒定我們還對另一個AP2基因(GhAP2)進(jìn)行了一些研究。構(gòu)建了pMD-GhAP2 RNAi融合表達(dá)載體，獲得轉(zhuǎn)基因棉花植株。對其中已經(jīng)種植的T0代轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行了DNA和RNA水平的鑒定，進(jìn)而對其開花后1天的陽性植株進(jìn)行離體胚珠培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，GhAP2 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花離體胚珠受外源ACC影響較大，但也不排除組培過程對T0代植株的影響。因此，需要進(jìn)一步對轉(zhuǎn)基因棉花后代植株進(jìn)行遺傳分析。另外，考慮到該基因可能參與乙烯應(yīng)答，過量表