MYB轉(zhuǎn)錄因子在棉花(Gossypium hirsutum)纖維發(fā)育中的功能研究.pdf

1、棉花是最主要的經(jīng)濟作物之一，在世界上廣泛種植。棉纖維是紡織工業(yè)、化工業(yè)和部分戰(zhàn)略物資的重要原料來源。棉纖維發(fā)育過程受到大量基因的調(diào)控，同時還受到油菜素內(nèi)酯(BR)等植物激素的調(diào)節(jié)。因此，研究與棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因的功能，進一步提高棉纖維品質(zhì)，對于國計民生有著重要的意義。
　　以Gh14-3-3e為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交篩選棉纖維的cDNA文庫，我們鑒定了一個與之相互作用的MYB蛋白，命名為GhMYBL2(cotton MYB-l

2、ike2)，并對其在纖維發(fā)育中的功能進行研究。所獲得的實驗結(jié)果如下:
　　1、GhMYBL2序列分析與表達載體構(gòu)建
　　GhMYBL2基因(cDNA)全長1217bp，開放閱讀框1086bp，編碼一個MYB蛋白。將該蛋白序列在NCBI網(wǎng)站進行比對，發(fā)現(xiàn)其含有2個MYB結(jié)構(gòu)域。分析表明，GhMYBL2在開花后9天的棉纖維中表達量最高。為了進一步分析GhMYBL2的生物學(xué)功能，構(gòu)建了35S-GhMYBL2和TUA9-GhMYBL

3、2過量表達載體，轉(zhuǎn)化棉花和擬南芥;同時，也構(gòu)建了35S-GhMYBL2、TUA9-GhMYBL2及RDL1-GhMYBL2 RNAi表達載體，轉(zhuǎn)化棉花。
　　2、GhMYBL2轉(zhuǎn)基因擬南芥表皮毛表型分析
　　有研究認為，棉纖維發(fā)育與擬南芥表皮毛發(fā)育類似。將35S-GhMYBL2過量表達載體導(dǎo)入擬南芥，獲得GhMYBL2轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。分析擬南芥表皮毛的性狀和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥表皮毛與野生型相比，出現(xiàn)了更多的二分支。此外

4、，將35S-GhMYBL2過量表達載體轉(zhuǎn)入無表皮毛的擬南芥gl1突變體，觀察發(fā)現(xiàn)T1和T2代35S-GhMYBL2/gl1轉(zhuǎn)基因擬南芥依然沒有表皮毛，而在T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥中部分株系產(chǎn)生了表皮毛，但表皮毛數(shù)量依然沒有野生型多，似乎表明GhMYBL2能夠部分恢復(fù)gl1突變體表型。BRI是BR信號中的關(guān)鍵受體，bri1突變體植株矮小，所以期待將35S-GhMYBL2過量表達載體轉(zhuǎn)入到bri1突變體中，分析表型，此實驗正在進行中。
　　

5、3、GhMYBL2轉(zhuǎn)基因棉花表型分析
　　將35S-GhMYBL2和TUA9-GhMYBL2過量表達載體，以及35S-GhMYBL2、TUA9-GhMYBL2和RDL1-GhMYBL2 RNAi載體轉(zhuǎn)化棉花，獲得大量的T0代轉(zhuǎn)基因棉花植株。目前已經(jīng)收獲了TUA9-GhMYBL2過量表達和RNAi轉(zhuǎn)基因棉花種子(T1和T2代)，進一步種植在大田和溫室中，分析轉(zhuǎn)基因植株表型及遺傳穩(wěn)定性。
　　將轉(zhuǎn)基因棉花T2代種子種植到溫室，鑒

6、定為陽性植株后，進行觀察和分析。在體外胚珠培養(yǎng)12天后，發(fā)現(xiàn)RNAi轉(zhuǎn)基因株系的纖維長勢明顯優(yōu)于野生型，而過量表達轉(zhuǎn)基因株系與野生型沒有明顯差別。用BL處理后，野生型和轉(zhuǎn)基因棉花纖維長度都有所增加，但與野生型相比較，過量表達轉(zhuǎn)基因棉花纖維長度增加更明顯。取開花后1天的胚珠制作切片觀察，也發(fā)現(xiàn)RNAi轉(zhuǎn)基因株系胚珠表面的纖維凸起明顯快于野生型，而過量表達凸起與野生型相當。對開花后9天的棉桃大小進行比較，發(fā)現(xiàn)RNAi轉(zhuǎn)基因株系的棉桃比野生型

7、大。對成熟棉纖維進行分析，發(fā)現(xiàn)RNAi轉(zhuǎn)基因棉纖維比野生型長，而過量表達轉(zhuǎn)基因棉纖維比野生型短，推測GhMYBL2可能在棉纖維發(fā)育中是一個負調(diào)控因子。此外，我們發(fā)現(xiàn)了一個棉花基因GhEXP1，它在過量表達轉(zhuǎn)基因棉花中的表達量下調(diào)，而在RNAi轉(zhuǎn)基因棉花中的表達量上調(diào)。
　　4、GhMYBL2多克隆抗體制備及相關(guān)實驗
　　構(gòu)建了ET32a-GhMYBL2蛋白表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，進行蛋白誘導(dǎo)表達純化。用純化的大量目的