GhDET2和GhKTN1在棉花纖維細(xì)胞發(fā)育中的功能.pdf

1、棉花是世界上最重要的天然纖維作物，我國(guó)是重要的產(chǎn)棉大國(guó)和紡織品出口國(guó)，棉花在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有十分重要的地位。棉花纖維是棉花生產(chǎn)的主產(chǎn)品，提高棉花纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)一直是棉花育種的主要目標(biāo)。傳統(tǒng)育種方法曾經(jīng)為棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的提高做出了巨大貢獻(xiàn)，但利用傳統(tǒng)育種方法難以打破纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的負(fù)相關(guān)，難以達(dá)到產(chǎn)量和品質(zhì)的同步提高。利用基因工程方法可以打破物種間的遺傳障礙，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良目的基因的定向轉(zhuǎn)移，且后代易于穩(wěn)定，育種周期短。為進(jìn)一步改良棉花纖維

2、產(chǎn)量和品質(zhì)提供了一條有效途徑。利用基因工程改良棉花纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)必須具備兩個(gè)條件：①清楚棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)形成的分子機(jī)理，②克隆與纖維產(chǎn)量和品質(zhì)發(fā)育直接相關(guān)的目標(biāo)基因和調(diào)控序列。因此，分離與棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)發(fā)育相關(guān)基因及其特異啟動(dòng)子，分析基因功能和解析纖維發(fā)育的分子機(jī)制對(duì)改良棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。 植物激素調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)方面，因此棉花纖維的生長(zhǎng)發(fā)育也離不開(kāi)植物激素的調(diào)控。油菜素類(lèi)固醇物質(zhì)(B

3、Rs)是一類(lèi)新型的植物激素，外源施用結(jié)果表明BRs能提高棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。然而外源施用植物激素不僅耗工費(fèi)時(shí)、增加生產(chǎn)成本，而且效果也不穩(wěn)定。利用基因工程調(diào)控棉花胚珠和纖維中內(nèi)源BRs的水平，不僅可以闡明BRs在棉花纖維發(fā)育中的作用，還可以改良棉花纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)。 細(xì)胞骨架在棉花纖維的生長(zhǎng)發(fā)育中也具有重要作用，纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)和次生壁的合成與周質(zhì)微管的排列模式具有密切關(guān)系。細(xì)胞伸長(zhǎng)時(shí)，周質(zhì)微管橫向排列；細(xì)胞次生壁合成時(shí)，周質(zhì)微管縱

4、向排列，且周質(zhì)微管的排列方向與新形成的纖維素微纖絲的排列方向高度一致。微管排列方向的變化與調(diào)控微管聚合和解聚的因子有直接關(guān)系，調(diào)控微管的排向可以影響纖維的伸長(zhǎng)和次生壁合成，改變纖維的品質(zhì)。 為了調(diào)控棉花內(nèi)源BRs的含量和微管骨架的排列模式，我們克隆了BRs生物合成的限速酶基因——類(lèi)固醇5α-還原酶基因和調(diào)控微管運(yùn)動(dòng)的重要基因——微管切割蛋白基因。并對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)分析和酶活性鑒定，然后利用煙草和棉花的遺傳轉(zhuǎn)化分析了棉花類(lèi)固醇5α-

5、還原酶基因(GhDET2)和棉花微管切割蛋白基因(GhKTN1)的功能。主要結(jié)果如下： 一、棉花類(lèi)固醇5α-還原酶基因(GhDET2)的功能1、棉花類(lèi)固醇5α-還原酶基因的克隆和表達(dá)分析通過(guò)對(duì)棉花纖維發(fā)育EST序列的篩選和整合，利用3’-RACE，克隆了GhDET2基因。該基因氨基酸序列與擬南芥、矮牽牛和大豆等物種的類(lèi)固醇5α-還原酶有較高的同源性，并具有同類(lèi)蛋白應(yīng)有的保守結(jié)構(gòu)域和發(fā)揮正常生物功能所必需的保守氨基酸殘基。說(shuō)明Gh

6、DET2基因是類(lèi)固醇5α-還原酶的同源基因。該基因在棉花基因組中以單拷貝存在，且編碼區(qū)段沒(méi)有內(nèi)含子。5’-上游序列比較表明GhDET2基因可能來(lái)源于D亞基因組。Northem和RT-PCR結(jié)果表明：GhDET2基因在棉花纖維細(xì)胞快速伸長(zhǎng)期(5～10DPA)的表達(dá)水平最高，同時(shí)該基因在徐州142無(wú)絨無(wú)絮突變體0DPA胚珠中的表達(dá)水平僅為同期野生型胚珠的1/5。這些結(jié)果顯示GhDET2基因在棉花纖維的起始和快速伸長(zhǎng)過(guò)程中具有重要作用。 2、

7、GhDET2的生物化學(xué)功能鑒定為了驗(yàn)證GhDET2的生物化學(xué)功能，將GhDET2基因?qū)胫袊?guó)倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞(CHO)中表達(dá)。體外還原系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果表明，GhDET2能夠?qū)㈩?lèi)固醇5α-還原酶的典型底物——黃體酮還原成為二氫黃體酮，說(shuō)明GhDET2具有類(lèi)固醇5α-還原酶的活性。并且GhDET2的活性能夠被類(lèi)固醇5α-還原酶的特異抑制劑——Finasteride抑制，進(jìn)一步說(shuō)明克隆的GhDET2基因就是棉花類(lèi)固醇5α-還原酶基因。 3、通

8、過(guò)轉(zhuǎn)基因煙草分析了GhDET2基因的功能為了分析GhDET2基因在植物生長(zhǎng)中的功能，將GhDET2基因?qū)霟煵荨hDET2基因的超量表達(dá)可以增加轉(zhuǎn)基因煙草的生物生長(zhǎng)量，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)基因種子的千粒重增加53.1﹪。下胚軸長(zhǎng)度增加80﹪。根的長(zhǎng)度增加190﹪。并且能夠促進(jìn)側(cè)根、不定根以及根毛的發(fā)生和生長(zhǎng)，以及增強(qiáng)根尖對(duì)重力的反應(yīng)。這些表型變異與外源施用BL有相似之處。同時(shí)利用類(lèi)固醇5α-還原酶的特異抑制劑Finasterid

9、e則可以抑制野生型煙草根和下胚軸的生長(zhǎng)，減弱轉(zhuǎn)基因煙草根和下胚軸的生長(zhǎng)。這些結(jié)果說(shuō)明超量表達(dá)GhDET2基因增加了內(nèi)源BRs的含量。并以此分析了BRs與其它植物激素的相互關(guān)系：IAA與BRs在對(duì)下胚軸生長(zhǎng)上是相互獨(dú)立的，對(duì)根生長(zhǎng)上是相互拮抗的；與此相反，IBA與BRs在對(duì)下胚軸生長(zhǎng)上是相互拮抗的，對(duì)根生長(zhǎng)上是相互獨(dú)立的。BRs與細(xì)胞分裂素對(duì)根的生長(zhǎng)具有獨(dú)立作用，而對(duì)下胚軸的生長(zhǎng)具有相互拮抗關(guān)系。BRs與赤霉素在根生長(zhǎng)方面存在協(xié)同作用關(guān)系

10、，而在對(duì)下胚軸生長(zhǎng)兩者具有一定的拮抗作用。BRs與脫落酸在種子萌發(fā)和根生長(zhǎng)方面具有拮抗作用，但對(duì)下胚軸的生長(zhǎng)具有相對(duì)獨(dú)立性。 4、超量表達(dá)和反義抑制GhDET2對(duì)棉花生長(zhǎng)和纖維細(xì)胞發(fā)育的影響為了研究GhDET2基因在棉花生長(zhǎng)發(fā)育、特別是纖維生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，獲得了超量表達(dá)和反義抑制GhDET2的轉(zhuǎn)基因棉花，分析了轉(zhuǎn)基因棉花的表型變化。超量表達(dá)GhDET2基因?qū)е旅藁ㄖ仓臧?cè)枝變短增多、頂端優(yōu)勢(shì)減弱；花粉育性下降、棉桃在開(kāi)花后

11、3～5天脫落、不能得到成熟的種子和纖維。反義抑制GhDET2基因?qū)е旅藁ㄖ仓陣?yán)重矮化、側(cè)枝變短、葉小色深；頂端優(yōu)勢(shì)和花粉育性喪失、棉桃在開(kāi)花后3～5天脫落、不能得到成熟的種子和纖維。 掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)反義抑制GhDET2的轉(zhuǎn)基因胚珠表面突起的纖維細(xì)胞明顯減少，而且伸長(zhǎng)受到抑制。進(jìn)一步采用胚珠離體觀察纖維細(xì)胞的發(fā)育：反義抑制GhDET2和類(lèi)固醇5α-還原酶抑制劑處理均導(dǎo)致纖維的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，而添加油菜素內(nèi)酯則可部分恢復(fù)纖維

12、細(xì)胞的伸長(zhǎng)。表明GhDET2對(duì)纖維細(xì)胞的起始與伸長(zhǎng)均有重要影響。 5、種皮特異啟動(dòng)子控制senseGhDET2提高了棉纖維細(xì)胞數(shù)量和長(zhǎng)度組成型超量表達(dá)正向與反義GhDET2基因?qū)е轮仓晟L(zhǎng)不正常，為了排除植株生長(zhǎng)不正常對(duì)纖維細(xì)胞發(fā)育的影響，利用種皮特異性啟動(dòng)子PFBP7構(gòu)建了PFBP7::senseGhDET2和PFBP7::antisenseGhDET2植物表達(dá)載體并進(jìn)行了棉花遺傳轉(zhuǎn)化。表達(dá)分析顯示GhDET2基因的表達(dá)水平在

13、部分PFBP7::senseGhDET2轉(zhuǎn)基因胚珠和纖維中有所提高，相反，在PFBP7::antisenseGhDET2轉(zhuǎn)基因胚珠和纖維中有一定程度的降低。在GhDET2基因表達(dá)明顯提高的植株中纖維細(xì)胞的起始數(shù)量增加了22.6﹪，成熟纖維的長(zhǎng)度增加了10.75﹪，種子變大，短絨增加，但纖維的強(qiáng)度和細(xì)度沒(méi)有明顯變化。相反，在PFBP7::antisenseGhDET2轉(zhuǎn)基因植株中，伴隨GhDET2基因表達(dá)水平的降低，纖維細(xì)胞的起始數(shù)量減少

14、了21.4﹪，成熟纖維的長(zhǎng)度降低了6.38﹪，這些結(jié)果在植株水平上說(shuō)明GhDET2基因?qū)γ蘩w維細(xì)胞的起始和伸長(zhǎng)具有重要作用，可作為基因工程改良棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的重要基因。 二、棉花微管切割蛋白基因(GhKTN1)的功能1、棉花微管切割蛋白基因的克隆和表達(dá)分析通過(guò)對(duì)棉花纖維發(fā)育EST序列的篩選和整合，克隆了棉花微管切割蛋白基因(GhKTN1)的部分cDNA序列。經(jīng)過(guò)基因組步行，獲得GhKTN1基因的完整ORF框序列，全長(zhǎng)1563b

15、p，編碼520個(gè)氨基酸。該氨基酸序列與擬南芥和水稻微管切割蛋白的同源性較高，且具有微管切割蛋白保守的AAATPase結(jié)構(gòu)域，推導(dǎo)的三維結(jié)構(gòu)與擬南芥微管切割蛋白的三維結(jié)構(gòu)基本一致。說(shuō)明GhKTNl基因是微管切割蛋白的同源基因。GhKTN1在16DPA和20DPA纖維中的表達(dá)水平明顯躍升。說(shuō)明該基因在纖維次生壁合成起始和次生壁合成過(guò)程中具有重要作用。 2、GhKTN1能夠調(diào)控纖維細(xì)胞次生壁合成起始和促進(jìn)次生壁合成Paredez等人(

16、2006)的研究表明，微管的運(yùn)動(dòng)與纖維素的合成密切相關(guān)。本研究中超量表達(dá)和反義抑制GhKTN1基因都使微管的排列方式發(fā)生明顯改變；微管切割蛋白基因表達(dá)水平的增加，可以促進(jìn)微管的運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而促進(jìn)纖維素的合成。本研究對(duì)弄清微管運(yùn)動(dòng)與纖維細(xì)胞發(fā)育的機(jī)理有重要的理論意義。 提高GhKTN1基因的表達(dá)水平導(dǎo)致纖維長(zhǎng)度縮短，纖維次生壁厚度增加，纖維強(qiáng)度增加：反之，降低GhKTN1基因的表達(dá)水平導(dǎo)致纖維次生壁厚度減少、纖維強(qiáng)度降低。GhKTN1