Gh3β-HSD基因在棉花纖維發(fā)育中的功能.pdf

1、棉花是世界上最重要的天然纖維作物之一，我國(guó)是世界上主要的棉花生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，棉花在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。棉花纖維是棉花的主要產(chǎn)品，其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程決定了成熟纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)。同時(shí)，棉花纖維作為極度伸長(zhǎng)的植物細(xì)胞，是研究植物細(xì)胞分化、生長(zhǎng)和次生壁增厚的理想材料，因此研究棉花纖維具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。棉花纖維細(xì)胞是棉花胚珠外珠被表皮細(xì)胞經(jīng)分化突起和極性伸長(zhǎng)而成的單細(xì)胞。其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程分為四個(gè)既明顯區(qū)分又有所重疊的時(shí)期:纖維細(xì)胞起

2、始期，纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)期，次生壁增厚期和脫水成熟期。近年來(lái)，許多研究者致力于探究纖維發(fā)育的分子機(jī)制，但迄今為止，調(diào)控纖維發(fā)育的關(guān)鍵基因和調(diào)控機(jī)理還不甚清楚。
　　 植物固醇是植物中一大類(lèi)具有甾環(huán)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，其中含量較高的有谷固醇、菜油固醇和豆甾醇等。植物固醇既是植物激素油菜素類(lèi)固醇(BRs)的合成前體，也是生物膜的組成成分之一，對(duì)生物膜的流動(dòng)性和透性有調(diào)控作用，因此在植物生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用。纖維細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中生物膜面積的擴(kuò)大十分

3、明顯，是變化劇烈的細(xì)胞器之一。作為膜組成成分和膜性質(zhì)調(diào)控因子的植物固醇可能在纖維發(fā)育中具有重要作用。C-4去甲基反應(yīng)是固醇合成中的一個(gè)關(guān)鍵反應(yīng)，由C-4去甲基復(fù)合酶體完成。為了探索植物固醇在纖維發(fā)育中的作用及其機(jī)制，本論文從棉花纖維中克隆了C-4去甲基復(fù)合酶體中的3β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶基因(Gh3β-HSD)。通過(guò)序列和表達(dá)特征分析、在煙草和棉花中超量表達(dá)以及在棉花中抑制該基因的表達(dá)，分析了該基因在棉花生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，特別是對(duì)纖維發(fā)育

4、的影響。獲得了如下的結(jié)果:
　　 1.克隆了棉花中3β-HSD的同源基因Gh3β-HSD
　　 利用擬南芥3β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶(At3β-HSD)蛋白質(zhì)序列搜索棉花EST數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)高同源性的EST序列進(jìn)行整合分析進(jìn)而設(shè)計(jì)特異引物從陸地棉徐州142野生型12DPA纖維的cDNA擴(kuò)增出一段特異序列。序列分析結(jié)果表明該序列長(zhǎng)2061bp，包含一個(gè)長(zhǎng)1683bp的完整ORF，由此推導(dǎo)的氨基酸序列長(zhǎng)560個(gè)氨基酸殘基，蛋白質(zhì)分

5、子量61.6KD，等電點(diǎn)為9.256。與cDNA序列對(duì)應(yīng)的基因組序列長(zhǎng)5039bp，由12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子組成。推導(dǎo)的氨基酸序列是一個(gè)膜結(jié)合蛋白，具有三個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。與擬南芥、煙草、楊樹(shù)和水稻等物種的3β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶具有較高的同源性，其中與葡萄3β-HSD的相同性為75％，相似性為86％;與擬南芥3β-HSD的相同性為70％，相似性為84％。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示棉花3β-HSD與葡萄、楊樹(shù)、蓖麻的3β-HSD的親緣關(guān)系較近。這些

6、結(jié)果證明克隆序列是3β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶基因的同源基因，命名為Gh3β-HSD。
　　 2.分析了Gh3β-HSD基因的表達(dá)特征
　　 基因的表達(dá)模式是分析基因功能的重要依據(jù)。為了初步分析Gh3β-HSD基因在棉花生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，通過(guò)定時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)了該基因的表達(dá)特征。該基因在纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平最高，其次在幼嫩莖、葉和胚珠中具有較高的表達(dá)水平，在根、子葉和下胚軸中的表達(dá)水平較低，在雄蕊中幾乎不表達(dá)。說(shuō)明Gh3

7、β-HSD基因的表達(dá)具有組織器官特異性，在纖維、胚珠、幼莖和葉中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。進(jìn)一步分析表明，該基因在6DPA至20DPA纖維中的表達(dá)水平高于相同發(fā)育時(shí)期的胚珠中以及0DPA和2DPA的胚珠（含纖維）中的表達(dá)水平，說(shuō)明該基因在纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，與纖維發(fā)育有密切關(guān)系。
　　 3.通過(guò)轉(zhuǎn)基因煙草分析了Gh3β-HSD基因啟動(dòng)子的功能
　　 為了更加準(zhǔn)確地了解Gh3β-HSD基因的時(shí)空表達(dá)特性和調(diào)控因素，本文克隆了該基因1987bp

8、的5'-上游調(diào)控序列。序列分析表明該序列中不僅包含許多光反應(yīng)元件和增強(qiáng)子序列，而且還包含厭氧反應(yīng)元件、真菌反應(yīng)元件、胚乳表達(dá)序列、防御和脅迫反應(yīng)元件、BRs響應(yīng)元件、水楊酸和乙烯反應(yīng)元件等。說(shuō)明Gh3β-HSD基因的表達(dá)受多種因素影響。進(jìn)而開(kāi)展了啟動(dòng)子刪除實(shí)驗(yàn)，以pBI121載體中的GUS基因?yàn)閳?bào)告基因，檢測(cè)了不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子序列在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)特性。結(jié)果顯示904bp的啟動(dòng)子序列在轉(zhuǎn)基因煙草中沒(méi)有表達(dá)活性，1598bp的啟動(dòng)子序列

9、在莖表皮毛和維管組織中具有較高的表達(dá)活性，而且在幼莖中的表達(dá)水平相對(duì)較高。該序列在葉表皮毛和葉肉中有一定量的表達(dá)，在根中的表達(dá)主要集中在根尖、根毛區(qū)和側(cè)根著生部位。同時(shí)其在葉和莖中的表達(dá)受水楊酸的誘導(dǎo)。
　　 4.通過(guò)轉(zhuǎn)基因煙草分析了Gh3β-HSD基因的功能
　　 為了盡快了解Gh3β-HSD基因的功能，首先在煙草中表達(dá)Gh3β-HSD基因。結(jié)果顯示在煙草中表達(dá)Gh3β-HSD基因增加了種子千粒重，并能促進(jìn)種子萌發(fā)。T

10、1代轉(zhuǎn)基因煙草的株高和主根長(zhǎng)度與對(duì)照相比有所增加，不過(guò)最明顯的是側(cè)根數(shù)量的增加。同時(shí)在煙草中表達(dá)該基因在一定程度上能夠提高煙草的耐鹽性。這些結(jié)果表明克隆的Gh3β-HSD基因是一個(gè)有功能的序列，超量表達(dá)Gh3β-HSD影響了煙草的生長(zhǎng)發(fā)育。
　　 5.Gh3β-HSD表達(dá)水平的變化影響了棉花植株的發(fā)育
　　 通過(guò)棉花的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株鑒定以及表達(dá)分析，獲得了超量表達(dá)和反義抑制Gh3β-HSD基因的轉(zhuǎn)基因棉花。T0代性

11、狀變異觀測(cè)結(jié)果顯示超量表達(dá)Gh3β-HSD轉(zhuǎn)基因棉花葉色較墨綠，果柄變長(zhǎng)，棉鈴變小，種子體積變大，數(shù)量變少，同時(shí)超量表達(dá)Gh3β-HSD降低了花粉育性。部分T1代超量表達(dá)Gh3β-HSD轉(zhuǎn)基因棉花側(cè)枝較短，節(jié)間縮短。相反抑制Gh3β-HSD的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因棉花植株極度矮小、葉片變小、節(jié)間變短、側(cè)枝變短。莖上表皮毛數(shù)量和野生型棉花相比明顯減少。大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株不能正常開(kāi)花，有少數(shù)植株能正常地開(kāi)花，但不能正常結(jié)桃。這些結(jié)果表明無(wú)論是超量表達(dá)G

12、h3β-HSD基因還是反義抑制Gh3β-HSD的表達(dá)都影響棉花植株的生長(zhǎng)，Gh3β-HSD在棉花植株的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有重要作用。
　　 6.Gh3β-HSD表達(dá)水平的變化對(duì)棉花纖維生長(zhǎng)發(fā)育的影響
　　 在棉花中增加Gh3β-HSD基因的表達(dá)抑制纖維的起始和伸長(zhǎng)。超量表達(dá)Gh3β-HSDT0代轉(zhuǎn)基因成熟纖維長(zhǎng)度與野生型沒(méi)有明顯區(qū)別，但T1代轉(zhuǎn)基因棉花纖維長(zhǎng)度與對(duì)照相比明顯變短。由于抑制Gh3β-HSD基因的表達(dá)不能得到成熟