GhLTP在棉花纖維發(fā)育中的功能研究.pdf

1、棉花是重要的天然纖維作物，棉纖維是紡織工業(yè)的原料來(lái)源，我國(guó)是世界上的棉花生產(chǎn)大國(guó)和消費(fèi)大國(guó)，棉花在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中具有舉足輕重的地位。棉纖維是由棉花胚珠外表皮細(xì)胞分化發(fā)育而來(lái)，其發(fā)育過(guò)程涉及多個(gè)代謝途徑，包括糖代謝、蛋白質(zhì)代謝和脂質(zhì)代謝等，是一個(gè)非常復(fù)雜的生理過(guò)程。已有的研究發(fā)現(xiàn)，在纖維發(fā)育過(guò)程中，脂質(zhì)代謝與糖、蛋白代謝一樣對(duì)纖維起始和伸長(zhǎng)發(fā)育具有重要的影響。脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(Lipid Transfer Protein，LTP)是植物生命活

2、動(dòng)中一類堿性的小分子蛋白質(zhì)，在體外能夠可逆結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸、磷脂、糖脂、類固醇等多種脂類復(fù)合物。因此，LTP在纖維發(fā)育過(guò)程中的功能研究，不僅對(duì)解析纖維細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)理具有重要的理論意義，而且可為纖維的基因工程改良提供理論基礎(chǔ)和目的基因。
　　課題組前期從陸地棉中克隆到一個(gè)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因（GhLTP）。為了明確該基因?qū)w維發(fā)育的影響，我們首先檢測(cè)了該基因在陸地棉各組織器官及不同發(fā)育階段的胚珠和纖維中的表達(dá)特性，然后克隆了其啟動(dòng)子

3、序列，分別在煙草和陸地棉中研究了該啟動(dòng)子的功能，同時(shí)通過(guò)調(diào)控該基因在陸地棉中的表達(dá)，研究了該基因?qū)w維伸長(zhǎng)發(fā)育的影響。獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.GhLTP的特征分析
　　我們所克隆的GhLTP包含一個(gè)長(zhǎng)度為363 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)由120個(gè)氨基酸殘基組成、分子量為11.9 kDa、等電點(diǎn)為8.5的蛋白質(zhì)。該序列還包含一個(gè)由77 bp組成的5'端非編碼區(qū)和一個(gè)由199 bp組成的3'端非編碼區(qū)。通過(guò)檢索二倍體雷蒙

4、德氏棉的基因庫(kù)，發(fā)現(xiàn)該基因位于基因組第11號(hào)染色體上。氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，GhLTP與NtLTP1及GhLTP7具有較高的同源性。對(duì)陸地棉各組織器官和不同發(fā)育階段的纖維及胚珠進(jìn)行GhLTP的表達(dá)特征分析，發(fā)現(xiàn)該基因在7至11天的纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。
　　2.GhLTP啟動(dòng)子克隆與功能分析
　　我們克隆了GhLTP上游啟動(dòng)子2467 bp的DNA序列，命名為PLTP2.5。進(jìn)一步在該序列的5，端刪除含有二十多個(gè)作用元件的1kb

5、序列，命名為PLTP1.5。將克隆的兩段DNA序列分別與GUS基因融合并構(gòu)建其對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子分析載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法分別對(duì)煙草和陸地棉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以研究GhLTP啟動(dòng)子在煙草和陸地棉中的表達(dá)特性。
　　轉(zhuǎn)基因煙草組織化學(xué)染色的檢測(cè)結(jié)果顯示，PLTP2.5啟動(dòng)子主要在葉片、葉柄、莖、花冠和花絲的表皮毛中表達(dá)，在柱頭及子房中少量表達(dá)，在根中不表達(dá)，。PLTP1.5的表達(dá)模式與PLTP2.5相似。表明GhLTP啟動(dòng)子在煙草中具有地

6、上組織表皮毛表達(dá)特異性。
　　轉(zhuǎn)基因棉花組織化學(xué)染色的檢測(cè)結(jié)果顯示，PLTP2.5和PLTP1.5在棉花中的表達(dá)特性基本上是一致的，即在開(kāi)花當(dāng)天的胚珠中有少量表達(dá)，開(kāi)花后3至15天的棉纖維中具有很強(qiáng)的表達(dá)活性，在萼片及花冠表皮毛中有表達(dá)，而在根、莖、葉片和葉柄中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)。表明GhLTP啟動(dòng)子在棉花中具有纖維細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)特性。
　　3.陸地棉中超量表達(dá)GhLTP抑制纖維伸長(zhǎng)
　　為解析GhLTP在棉纖維發(fā)育中的

7、功能，我們將該基因置于CaMV35S啟動(dòng)子下游并轉(zhuǎn)入陸地棉冀棉14中，共獲得20個(gè)轉(zhuǎn)化子106株轉(zhuǎn)基因棉花植株。表型觀察分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因棉花植株生長(zhǎng)正常，能夠正常開(kāi)花、授粉和結(jié)鈴，表明該基因的超量表達(dá)并不會(huì)影響陸地棉的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)。
　　利用掃描電鏡觀察GhLTP表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因棉花植株23-1與29-1的0至2天的胚珠，與野生型相比，開(kāi)花當(dāng)天(0 DPA)的胚珠表面纖維細(xì)胞的起始數(shù)量明顯減少，開(kāi)花后1天(1 DPA)和開(kāi)花

8、后2天(2 DPA)胚珠表面的纖維長(zhǎng)度均短于野生型。通過(guò)檢測(cè)成熟棉纖維的品質(zhì)發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因棉花成熟纖維長(zhǎng)度均變短。其中，纖維長(zhǎng)度降低范圍為2.6％至21.7％，表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因棉花植株29-1，23-1，15-2的纖維長(zhǎng)度分別降低了14.2％，16.5％，11.9％。表明GhLTP在陸地棉中的超量表達(dá)會(huì)抑制纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)。
　　綜合以上結(jié)果，我們得出如下的結(jié)論，GhLTP啟動(dòng)子的表達(dá)具有表皮毛和纖維特異性，陸地棉中該基