IGFBP-4誘導(dǎo)iPSCs向心肌細(xì)胞分化及PML-NBs蛋白對Rep蛋白介導(dǎo)的AAV質(zhì)粒整合系統(tǒng)防御機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分 IGFBP-4誘導(dǎo)iPSCs向心肌細(xì)胞分化的研究
　　誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)可以產(chǎn)生患者特異心肌細(xì)胞，這為研究心血管疾病發(fā)病機(jī)制和個(gè)體化細(xì)胞治療提供了無限可能。但是iPSCs向心肌細(xì)胞分化效率過低是限制其應(yīng)用的主要因素。
　　Wnt/β-catenin細(xì)胞信號通路在心臟發(fā)生中具有重要作用。IGFBP-4是最近發(fā)現(xiàn)的Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑，因此我們推測，IGFBP-4可作為一個(gè)研究iPSCs

2、向心肌細(xì)胞分化的有價(jià)值分子。
　　本研究中，首先運(yùn)用統(tǒng)計(jì)跳動克隆數(shù)目的方法確定了添加IGFBP-4在不同的時(shí)間點(diǎn)和不同的濃度條件下對克隆跳動率的影響。通過免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了6-8天添加IGFBP-4可以顯著性的提高心肌特異性蛋白和基因的表達(dá)。利用激光共聚焦觀察免疫熒光染色的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)IGFBP-4誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞表達(dá)心肌樣特異性蛋白。添加IGFBP-4沒有促進(jìn)中胚層標(biāo)志基因Bra

3、chyury的表達(dá)，但是促進(jìn)了心肌早期轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。進(jìn)一步，我們確定了IGFBP-4還會影響中胚層分化來的其他細(xì)胞類型標(biāo)志基因的表達(dá)，這說明了過表達(dá)IGFBP-4促進(jìn)向心肌細(xì)胞分化并不是特異性的。對全能性基因和與凋亡相關(guān)指標(biāo)的檢測表明，IGFBP-4不會提前iPSCs分化時(shí)間且沒有造成細(xì)胞的凋亡。IGFBP-4是Wnt/β-catenin通路的抑制劑，它顯著性的降低了β-catenin蛋白的表達(dá)量。我們的研究首次把IGFBP-4用于i

4、PSCs向心肌分化的研究，證明了IGFBP-4可以非特異性的提高向心肌分化，并深入的研究了促進(jìn)分化發(fā)生的重要階段，為研究iPSCs向心肌分化提供了線索并打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，這將為心力衰竭的細(xì)胞治療做出貢獻(xiàn)。
　　第二部分PML-NBs SP100對Rep蛋白介導(dǎo)的AAV質(zhì)粒整合系統(tǒng)防御機(jī)制研究
　　利用Rep蛋白介導(dǎo)的AAV質(zhì)粒整合系統(tǒng)來研究AAVS1的定點(diǎn)整合機(jī)制并驗(yàn)證其整合能力的研究工作已有很多。該質(zhì)粒系統(tǒng)由反式提供Rep蛋

5、白的pRC質(zhì)粒和攜帶AAV順式整合原件的質(zhì)粒所組成。之前的研究都是集中在質(zhì)粒載體本身，關(guān)于細(xì)胞對該整合系統(tǒng)的反應(yīng)并不清楚。
　　SP100蛋白是PML-NBs的重要組成蛋白，它參與了許多細(xì)胞反應(yīng)包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和針對入侵病毒的細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)。在我們的研究中，利用克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SP100蛋白可以抑制Rep蛋白介導(dǎo)的AAV質(zhì)粒整合系統(tǒng)的整合效率。相應(yīng)的，短暫表達(dá)Rep78蛋白可以降解SP100蛋白，并且這種降解在加入蛋白酶體抑制劑MG1

6、32的時(shí)候可以被回復(fù)，提示該降解是通過泛素化途徑進(jìn)行的。通過激光共聚焦發(fā)現(xiàn)SP100和Rep78都存在于細(xì)胞核當(dāng)中，這種空間上的共定位提示了二者互相作用的可能性。我們用免疫共沉淀的方法對SP100和Rep78的相互作用可能性進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證，Rep78蛋白可以與(EGFP)-SP100融合蛋白共沉淀，卻不能與EGFP蛋白共沉淀，確認(rèn)了SP100和Rep78之間的相互作用。
　　這些研究工作不但豐富了SP100蛋白的功能和細(xì)胞對Re