IGFBP-4誘導(dǎo)iPSCs向心肌細胞分化及PML-NBs蛋白對Rep蛋白介導(dǎo)的AAV質(zhì)粒整合系統(tǒng)防御機制的研究.pdf

1、第一部分 IGFBP-4誘導(dǎo)iPSCs向心肌細胞分化的研究
　　誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)可以產(chǎn)生患者特異心肌細胞，這為研究心血管疾病發(fā)病機制和個體化細胞治療提供了無限可能。但是iPSCs向心肌細胞分化效率過低是限制其應(yīng)用的主要因素。
　　Wnt/β-catenin細胞信號通路在心臟發(fā)生中具有重要作用。IGFBP-4是最近發(fā)現(xiàn)的Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑，因此我們推測，IGFBP-4可作為一個研究iPSCs

2、向心肌細胞分化的有價值分子。
　　本研究中，首先運用統(tǒng)計跳動克隆數(shù)目的方法確定了添加IGFBP-4在不同的時間點和不同的濃度條件下對克隆跳動率的影響。通過免疫熒光染色實驗，免疫印跡實驗和熒光定量PCR實驗，我們進一步驗證了6-8天添加IGFBP-4可以顯著性的提高心肌特異性蛋白和基因的表達。利用激光共聚焦觀察免疫熒光染色的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)IGFBP-4誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞表達心肌樣特異性蛋白。添加IGFBP-4沒有促進中胚層標志基因Bra

3、chyury的表達，但是促進了心肌早期轉(zhuǎn)錄因子的表達。進一步，我們確定了IGFBP-4還會影響中胚層分化來的其他細胞類型標志基因的表達，這說明了過表達IGFBP-4促進向心肌細胞分化并不是特異性的。對全能性基因和與凋亡相關(guān)指標的檢測表明，IGFBP-4不會提前iPSCs分化時間且沒有造成細胞的凋亡。IGFBP-4是Wnt/β-catenin通路的抑制劑，它顯著性的降低了β-catenin蛋白的表達量。我們的研究首次把IGFBP-4用于i

4、PSCs向心肌分化的研究，證明了IGFBP-4可以非特異性的提高向心肌分化，并深入的研究了促進分化發(fā)生的重要階段，為研究iPSCs向心肌分化提供了線索并打下了實驗基礎(chǔ)，這將為心力衰竭的細胞治療做出貢獻。
　　第二部分PML-NBs SP100對Rep蛋白介導(dǎo)的AAV質(zhì)粒整合系統(tǒng)防御機制研究
　　利用Rep蛋白介導(dǎo)的AAV質(zhì)粒整合系統(tǒng)來研究AAVS1的定點整合機制并驗證其整合能力的研究工作已有很多。該質(zhì)粒系統(tǒng)由反式提供Rep蛋

5、白的pRC質(zhì)粒和攜帶AAV順式整合原件的質(zhì)粒所組成。之前的研究都是集中在質(zhì)粒載體本身，關(guān)于細胞對該整合系統(tǒng)的反應(yīng)并不清楚。
　　SP100蛋白是PML-NBs的重要組成蛋白，它參與了許多細胞反應(yīng)包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和針對入侵病毒的細胞內(nèi)免疫反應(yīng)。在我們的研究中，利用克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)SP100蛋白可以抑制Rep蛋白介導(dǎo)的AAV質(zhì)粒整合系統(tǒng)的整合效率。相應(yīng)的，短暫表達Rep78蛋白可以降解SP100蛋白，并且這種降解在加入蛋白酶體抑制劑MG1

6、32的時候可以被回復(fù)，提示該降解是通過泛素化途徑進行的。通過激光共聚焦發(fā)現(xiàn)SP100和Rep78都存在于細胞核當中，這種空間上的共定位提示了二者互相作用的可能性。我們用免疫共沉淀的方法對SP100和Rep78的相互作用可能性進行了進一步驗證，Rep78蛋白可以與(EGFP)-SP100融合蛋白共沉淀，卻不能與EGFP蛋白共沉淀，確認了SP100和Rep78之間的相互作用。
　　這些研究工作不但豐富了SP100蛋白的功能和細胞對Re