電刺激對維生素C誘導(dǎo)iPSCs向心肌細胞分化影響的實驗研究.pdf

1、目的：探討電刺激在體外對維生素C誘導(dǎo)iPSCs向心肌細胞分化的作用。
　　方法：1.復(fù)蘇小鼠來源的iPSCs，接種于絲裂霉素C預(yù)處理的MEF飼養(yǎng)層上，通過光學(xué)顯微鏡觀察iPSCs生長的形態(tài)變化特征，熒光顯微鏡觀察干細胞全能性基因Oct-4的表達以及堿性磷酸酶(AP)染色三個方面鑒定未分化的iPSCs。
　　2.采用懸滴法使iPSCs形成EBs，維生素C誘導(dǎo)其分化，按是否給予電刺激將其分為電刺激組與非電刺激組。觀察各組細胞生長

2、情況，記錄各組擬胚體出現(xiàn)跳動的時間和跳動擬胚體的數(shù)量，計算心肌細胞分化率。共聚焦顯微鏡成像結(jié)合免疫熒光細胞化學(xué)檢測心肌特異性肌鈣蛋白(c-TnT)的表達。RT-PCR檢測Oct-4、心肌早期特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和心肌特異性肌球蛋白重鏈α-MHC的基因表達。
　　結(jié)果：1.接種于MEF飼養(yǎng)層的iPSCs呈散在分布的克隆團貼壁生長，iPSCs集落中央的細胞排列緊密，邊緣折光性強，與飼養(yǎng)層細胞界限清楚;在熒光顯微鏡下，GFP轉(zhuǎn)Oc

3、t-4基因的iPSCs細胞呈現(xiàn)綠色熒光集落（Oct-4陽性）;AP染色顯示，iPSCs克隆團著深紫色。
　　2.兩組在誘導(dǎo)分化過程中均出現(xiàn)自發(fā)搏動的擬胚體，電刺激組擬胚體較非電刺激組分化更快，更早出現(xiàn)自發(fā)搏動（3天vs5天），心肌細胞分化率更高[(68.89±5.09)％vs（52.22±3.85）％]，差異有顯著性，P＜0.05。
　　3.兩組搏動區(qū)域細胞均表達心肌特異性肌鈣蛋白c-TnT，電刺激組細胞c-TnT表達更清楚

4、。
　　4.在誘導(dǎo)分化過程中，Oct-4 mRNA表達隨誘導(dǎo)時間延長逐漸降低，電刺激組較非電刺激組降低更快(P＜0.05)。兩組均檢測到心肌細胞特異性標記分子GATA-4和α-MHC的表達。在誘導(dǎo)分化相同時間點，電刺激組GATA-4和α-MHC表達水平均高于非電刺激組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：在LIF和絲裂霉素C預(yù)處理的MEF飼養(yǎng)層環(huán)境中，iPSCs保持未分化狀態(tài)不斷增殖;模擬心臟電學(xué)微環(huán)境的電刺激在一定程度上有助于維生