TFEB的SUMO化修飾在巨噬泡沫細胞形成中的作用.pdf

1、研究背景：
　　動脈粥樣硬化是誘發(fā)心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，巨噬泡沫細胞的形成是動脈粥樣硬化發(fā)病早期典型的病理改變。最新研究證實，巨噬細胞的自噬溶酶體活性與膽固醇代謝狀況以及泡沫細胞的形成密切相關(guān)。因此，調(diào)控巨噬細胞的自噬過程，減少巨噬泡沫細胞的形成，成為治療動脈粥樣硬化及相關(guān)疾病的核心。近年來，SUMO(small ubiquitin-related modifier)化修飾作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程，參與胚胎發(fā)生發(fā)育

2、、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理病理過程，已成為近年來研究的熱點。我們前期研究證實調(diào)控自噬溶酶體生成最重要的轉(zhuǎn)錄因子TFEB(transcription factor EB)能夠發(fā)生SUMO化修飾，因此，我們推測TFEB的SUMO化修飾通過調(diào)控自噬溶酶體生成參與了巨噬泡沫細胞的形成。
　　目的：
　　本研究通過觀察TFEB的SUMO化修飾對巨噬細胞自噬體溶酶體生成的影響，深入探討其在動脈粥樣硬化巨噬泡沫細胞形成過程中的作用及機制。這些研

3、究將有助于進一步了解蛋白質(zhì)SUMO化修飾及其調(diào)控的生物學(xué)功能，并進一步了解巨噬泡沫細胞形成的機理及在動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用。
　　方法：
　　一、培養(yǎng)THP-1巨噬細胞，給予氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)處理24h，應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)檢測巨噬細胞TFEB的SUMO化修飾水平的變化。
　　二、運用慢病毒技術(shù)構(gòu)建過表達人TFEB(TFEB)和SUMO化位點突變的TFEBTHP-1(TFEB K316R)巨噬細胞株，以空

4、載病毒細胞作為陰性對照組，應(yīng)用電鏡技術(shù)觀察各組巨噬細胞自噬生成情況;應(yīng)用免疫熒光技術(shù)及western blot檢測各組巨噬細胞自噬生成標志LC3的表達情況。
　　三、培養(yǎng)過表達TFEB和SUMO化位點突變的TFEB巨噬細胞，以空載病毒細胞作為陰性對照組，應(yīng)用電鏡技術(shù)及Lysotracker染色觀察各組巨噬細胞溶酶體生成情況;應(yīng)用免疫熒光技術(shù)及western blot檢測各組巨噬細胞中溶酶體生成標志LAMP1的表達情況。
　　

5、四、培養(yǎng)過表達TFEB和SUMO化位點突變的TFEB巨噬細胞，以空載病毒細胞作為陰性對照組，應(yīng)用實時熒光定量PCR的方法檢測各組巨噬細胞TFEB下游靶基因（自噬及溶酶體生成相關(guān)基因）的表達情況。
　　五、培養(yǎng)過表達TFEB和SUMO化位點突變的TFEB巨噬細胞，以空載病毒細胞作為陰性對照組，給予ox-LDL處理24h，通過熒光分光光度計檢測各組巨噬細胞總膽固醇(TC)、膽固醇酯(CE)含量及膽固醇酯水解率;用液體閃爍計數(shù)法檢測各組

6、巨噬細胞膽固醇流出率;
　　六、培養(yǎng)過表達TFEB和SUMO化位點突變的TFEB巨噬細胞，以空載病毒細胞作為陰性對照組，給予ox-LDL處理24h，應(yīng)用油紅O及Nile red染色觀察各組巨噬細胞泡沫細胞形成情況。
　　結(jié)果：
　　一、在巨噬泡沫細胞形成過程中，TFEB的SUMO化修飾水平的改變
　　培養(yǎng)人THP-1巨噬細胞，我們檢測到了內(nèi)源性TFEB的SUMO化修飾條帶。并且，給予50μg/mL ox-LDL刺

7、激24h后，發(fā)現(xiàn)TFEB的SUMO化修飾水平較對照組明顯降低，說明在ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細胞泡沫化過程中，TFEB的SUMO化修飾水平受到顯著抑制。
　　二、TFEB的SUMO化修飾對巨噬細胞自噬的影響
　　電鏡結(jié)果顯示:與對照組相比，TFEB組巨噬細胞內(nèi)自噬體的數(shù)量明顯增加，而TFEB K316R組巨噬細胞內(nèi)自噬體的數(shù)量明顯較TFEB組顯著減少(均P＜0.05)。并且，TFEB組巨噬細胞內(nèi)自噬生成標志LC3的蛋白表達量較T

8、FEB K316R組顯著明顯增加。這些結(jié)果說明TFEB的SUMO化修飾促進巨噬細胞自噬。
　　三、TFEB的SUMO化修飾對巨噬細胞溶酶體生成的影響
　　電鏡和Lysotracker染色結(jié)果顯示:與對照組相比，TFEB組巨噬細胞溶酶體數(shù)量增多（P＜0.05），體積增大;而TFEB K316R組巨噬細胞內(nèi)溶酶體數(shù)量和體積較對照組無明顯差異。并且，TFEB組巨噬細胞溶酶體生成標志LAMP1的蛋白表達量較TFEBK316R組明顯增

9、加。這些結(jié)果說明TFEB的SUMO化修飾促進巨噬細胞溶酶體的生成。
　　四、TFEB的SUMO化修飾對TFEB下游自噬及溶酶體生成基因表達的影響
　　與對照組相比，過表達TFEB明顯增加巨噬細胞自噬(LC3，ULK1，WIP1，ATG9B，Becline1)和溶酶體(LAMP1，CTSB，CLCN7，ATP6V1A)生成相關(guān)基因的表達，但是TFEB K316R組內(nèi)自噬溶酶體生成相關(guān)基因的表達量較TFEB組明顯降低(均P＜0.

10、05)。這些結(jié)果說明TFEB的SUMO化修飾促進巨噬細胞自噬及溶酶體生成相關(guān)基因的表達。
　　五、TFEB的SUMO化修飾對巨噬泡沫細胞膽固醇流出的影響
　　與對照組相比，TFEB組巨噬細胞內(nèi)TC和CE含量明顯降低，膽固醇酯水解程度顯著增加，apoA-Ⅰ介導(dǎo)的膽固醇流出增多（均P＜0.05）;而TFEB K316R組巨噬細胞內(nèi)TC和CE含量較TFEB組明顯增加，膽固醇酯水解程度顯著降低，apoA-Ⅰ介導(dǎo)的膽固醇流出減少(均P

11、＜0.05)。這些結(jié)果說明TFEB的SUMO化修飾促進巨噬細胞內(nèi)膽固醇酯的水解，增加膽固醇的流出。
　　六、TFEB的SUMO化修飾對巨噬泡沫細胞形成的影響
　　油紅O及Nile red染色結(jié)果顯示:與對照組相比，TFEB組巨噬細胞內(nèi)脂滴聚集及泡沫細胞形成明顯減少;而TFEB K316R組巨噬細胞內(nèi)脂滴聚集及泡沫細胞形成較TFEB組顯著增多，這些結(jié)果說明，TFEB的SUMO化修飾抑制了巨噬泡沫細胞的形成。
　　結(jié)論：<