Nur77的SUMO化修飾在乳腺癌細(xì)胞中的功能.pdf

1、細(xì)胞核受體家族成員的數(shù)目繁多，它們通過(guò)對(duì)下游因子的調(diào)控，在細(xì)胞內(nèi)形成強(qiáng)大有序的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。在細(xì)胞調(diào)節(jié)中，核受體家族成員大多受特異性配體激活，比較特殊的一類為孤兒核受體亞族，該亞族成員的配體未知或無(wú)需配體激活就能行使核受體功能。孤兒核受體家族NR4A(Nuclear receptor subfamily4 group A)即屬于后者，其中Nur77（即NR4A1）的作用廣泛，多篇文獻(xiàn)報(bào)道了Nur77在神經(jīng)發(fā)育、刺激應(yīng)答等多領(lǐng)域的核心作用。近

2、年來(lái)，Nur77在癌癥研究中的價(jià)值也開(kāi)始顯現(xiàn)，在前列腺癌、肺癌、膀胱癌等的研究中，Nur77的異常表達(dá)，能夠影響癌癥發(fā)生。乳腺癌細(xì)胞中，Nur77的表達(dá)量遠(yuǎn)高于正常的乳腺細(xì)胞，這種異常表達(dá)對(duì)乳腺癌的發(fā)生是否存在影響還尚未知曉。雌激素受體α（Estrogen receptorα，ERα）作為乳腺癌發(fā)病因子，是該病癥研究的主要核心。由此，在判斷Nur77對(duì)乳腺癌細(xì)胞影響的過(guò)程中，與ERα間的作用及聯(lián)系將成為研究的重點(diǎn)。作為小蛋白類泛素化修飾

3、的SUMO化修飾(Small ubiquitin-related modifer，SUMO)與泛素化修飾在對(duì)底物蛋白的識(shí)別和位點(diǎn)結(jié)合過(guò)程中都存在競(jìng)爭(zhēng)性，能夠極大地影響蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)定位、穩(wěn)定性等。上文提及的NR4A家族成員中另一成員Nurr1（即NR4A2）已經(jīng)證實(shí)可以受SUMO化修飾，在結(jié)構(gòu)和功能上具有保守性的同家族成員Nur77的相關(guān)研究尚未開(kāi)展。
　　綜上，本研究重點(diǎn)在于Nur77作為ERα的輔激活因子促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng);同

4、時(shí)，Nur77能被SUMO蛋白修飾，SUMO化對(duì)Nur77在乳腺癌細(xì)胞中的功能產(chǎn)生抑制作用。主要內(nèi)容如下:
　　1.通過(guò)對(duì)Nur77的氨基酸序列進(jìn)行分析，賴氨酸K102和K557是潛在的SUMO化修飾位點(diǎn)。在Hela細(xì)胞中，通過(guò)免疫印跡和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確定了Nur77是SUMO化修飾的底物。接下來(lái)的免疫熒光驗(yàn)證了兩者在細(xì)胞中存在共定位。為了進(jìn)一步確定Nur77的SUMO化修飾位點(diǎn)，采用定點(diǎn)突變的方式，構(gòu)建了3種不同的點(diǎn)突變體，單突

5、變K102R、K577R，雙突變的2KR。后期的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中，與野生型的Nur77相比，突變體K577與2KR都無(wú)法與SUMO發(fā)生共價(jià)性的相互作用，確定主要修飾位點(diǎn)是K577。
　　2.Hela細(xì)胞中，通過(guò)免疫共沉淀和免疫熒光實(shí)驗(yàn)確定了ERα和Nur77間存在相互作用。接下來(lái)的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中顯示Nur77促進(jìn)ERα的轉(zhuǎn)錄活性，并且呈劑量依賴性，推斷Nur77是ERα的輔激活因子，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。
　　3.通過(guò)