Sumo化修飾在Hedgehog信號通路轉錄因子Gli2活性調節(jié)中的作用研究.pdf

1、分泌型Hedgehog(Hh)家族在脊椎動物和非脊椎動物的胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。脊椎動物Hh信號功能的缺失導致很多發(fā)育畸形，包括前腦無裂畸形、多指/趾畸形、顱面缺損和骨骼形成缺損。同時，Hh信號通路的異常激活也與很多類型的人類惡性腫瘤有關，如腦膠質瘤、髓母細胞瘤、食管癌、直腸癌、小細胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌。因此全面了解Hh信號轉導的分子機制，不僅可以闡明胚胎發(fā)育的分子機制，同時也可以預防和治療Hh相關的腫瘤。
　

2、　 在脊椎動物，Hh配體與細胞表面的受體Patched(Ptch)結合，這一結合可阻止Ptch對Smoothened(Smo)蛋白的抑制，從而允許Hh通路得以激活。Hh信號通路有3個Gli轉錄因子對其進行調節(jié):Glil、Gli2、Gli3。其中，Gli2、Gli3具備雙重轉錄活性，在有Hh信號存在時為激活狀態(tài)(Gli2A/Gli3A)，在無Hh信號時經(jīng)蛋白酶水解加工成為抑制狀態(tài)(Gli2R/Gli3R)。Gli1是Gli2A/Gli3

3、A的直接作用轉錄基因，只具有激活子功能。Gli2是調節(jié)Hh信號通路的主要的轉錄激活子。目前，Hh信號和蛋白修飾物如何調節(jié)Gli蛋白的功能尚未得到完全了解。
　　 小泛素樣修飾蛋白（Sumo）是一個有100個氨基酸的多肽，可通過與泛素化類似的方式與靶蛋白共價結合。Sumo修飾對靶蛋白的功能有多種效應。比如，轉錄因子Sumo化修飾之后大多會使轉錄過程受抑制，但是偶爾也會發(fā)現(xiàn)它有激活轉錄過程的效應。
　　 本次研究通過細胞培養(yǎng)

4、實驗及轉基因小鼠在體實驗，探討了Sumo與Gli2轉錄因子的相關性、Sumo化修飾對Gli2蛋白轉錄活性的影響及影響這一修飾的因素及作用機制。
　　 第一章Sumo與轉錄因子Gli2的相關性研究
　　 第一節(jié)體內實驗中Gli2蛋白與Sumo的相關性研究
　　 [目的]
　　 探究在體內可與Gli2蛋白相互作用的修飾蛋白，證實Gli2蛋白可以發(fā)生Sumo化修飾。
　　 [方法]
　　 取胎齡

5、10.5天的野生型小鼠胚胎肢芽，將其中的信使RNA（mRNA）分離出來，反轉錄得到野生型小鼠肢芽cDNA文庫，將其重組入Pjg4-5載體。用Gli2蛋白羧基末端片段Gli2-584-1024aa來構建誘餌質粒pNlex-Gli2-584-1024aa，使用酵母雙雜合篩選法篩選小鼠肢芽cDNA文庫，尋找可與Gli2相互作用的修飾蛋白。
　　 [結果]
　　 通過酵母雙雜合系統(tǒng)篩選胎鼠肢芽cDNA文庫得到兩個基因編碼的蛋白可

6、與Gli2相互作用，它們是Sumo2和Pias1（一個SumoE3結合酶）。通過該實驗證實在體內Gli2蛋白存在Sumo化修飾。
　　 [討論]
　　 哺乳動物細胞培養(yǎng)結果顯示，通過免疫共沉淀方法未能證實Gli2與Sumo2或Pias1存在相互作用，提示我們，這一相互作用過程很短暫。
　　 第二節(jié)HEK293培養(yǎng)細胞內Gli2蛋白與Sumo的相關性研究
　　 [目的]
　　 探究在體外培養(yǎng)細胞中G

7、li2蛋白是否發(fā)生Sumo化修飾，在PDD(Gli2羧基端的一個結構域-processingdeterminantdomain蛋白加工決定域)結構域內的兩個Sumo化位點是否被Sumo修飾。
　　 [方法]
　　 1、將HA標記的Sumo2基因HA-Sumo2、Gli2基因分別單獨及共同在細胞中表達，將細胞裂解提取蛋白，使用Gli2抗體對細胞蛋白進行免疫沉淀作用，使用HA抗體進行免疫印跡實驗，檢測細胞中Sumo與Gli2

8、蛋白是否存在相互作用;
　　 2、將UBC9基因（E2Sumo結合酶）和UBC9DN基因(UBC9的負性結構)分別與HA-Sumo2基因、Gli2基因一起在細胞中表達，將細胞裂解提取蛋白，使用Gli2抗體對細胞蛋白進行免疫沉淀作用，使用HA抗體進行免疫印跡實驗，檢測有無Sumo結合酶基因共表達的細胞中Sumo化的Gli2蛋白表達量是否有區(qū)別;
　　 3、將GST融合野生型PDD基因、變異型PDD基因(PDD中兩個Sumo

9、化位點突變)分別與HA-Sumo2基因一起在細胞中表達，將細胞裂解提取蛋白，經(jīng)GST融合蛋白沉降技術沉降蛋白，使用HA抗體進行免疫印跡實驗，檢測有無Sumo化位點突變的PDD基因共表達的細胞中Sumo化的Gli2蛋白表達量是否有區(qū)別。
　　 [結果]
　　 1、只有當HA-Sumo2與Gli2在細胞中共表達時才能檢測到Sumo化的Gli2蛋白的免疫反應信號，各自單獨表達時則不能;
　　 2、將UBC9與Gli2、

10、Sumo2共表達時可顯著提高Gli2蛋白Sumo化修飾的水平，而UBC9DN與上述兩個基因共表達時則完全抑制Gli2蛋白Sumo化修飾;
　　 3、Gli2蛋白Sumo化修飾在野生型PDD表達的細胞可以監(jiān)測到，但在單個或兩個Sumo化位點突變的變異型PDD表達的細胞Sumo化修飾顯著減少或徹底消失。
　　 [討論]
　　 因為免疫沉淀反應發(fā)生在蛋白變性以后，所以實驗1中檢測到的信號應該是Sumo化修飾的Gli2，

11、而不是與Gli2相互關聯(lián)的蛋白;實驗2表明Gli2蛋白Sumo化修飾是特異性的;實驗3表明在細胞內PDD結構域中兩個Sumo化位點被Sumo修飾。
　　 第二章體內外研究中Sumo化修飾對Gli2蛋白轉錄活性的影響
　　 第一節(jié)體內實驗中Sumo化修飾對Gli2蛋白轉錄活性的影響
　　 [目的]
　　 探究Sumo化修飾在體內Hh信號通路中的作用及在體內對Gli2蛋白轉錄活性的影響。
　　 [方法

12、]
　　 制備攜帶變異型Gli2基因Gli2K2R的突變小鼠（將Gli2K630、K716位置的Sumo化位點突變），選取野生型和突變型El0.5胚胎，提取蛋白，用包含特異的Gli結合位點的雙鏈寡核苷酸將Gli2蛋白富集濃縮，免疫印跡分析使用Gli2抗體，檢測該突變小鼠體內Gli2蛋白加工過程是否受影響;其次測定發(fā)育中的胎鼠神經(jīng)管上神經(jīng)元細胞的特異性分化和圖式發(fā)育（該過程與Hh信號通路有密切關系）:雌鼠受孕10.5天后，將其處死

13、，取胚胎固定、包埋，制備冰凍切片，使用相應抗體對組織切片行免疫染色，熒光顯微鏡下觀察切片。
　　 [結果]
　　 1、成功制備Gli2K2R突變小鼠后，檢測突變小鼠體內Gli2蛋白表達水平，結果表明突變體Gli2K2R與野生型Gli2蛋白表達水平相當。
　　 2、在野生型胚胎，底板、V3祖細胞、運動神經(jīng)元在腹側神經(jīng)管的特定區(qū)域特化和圖式發(fā)育。他們分別可被轉錄因子FOXA2，NKX2.2，andHB9andISl1

14、表達標記。NKX6.1的表達從底板覆蓋至V1祖細胞。與此相反，PAX6、PAX7的表達位于背側神經(jīng)管，他們兩個分別在腹側神經(jīng)管的大部分和全部區(qū)域表達缺失，因為他們的表達被Hh信號抑制。與野生型胚胎相比，這些轉錄因子在突變型Gli2K2R純合子胚胎神經(jīng)管上的表達和圖式發(fā)育無明顯差別。使用lacZ報告基因嵌入Ptch1位置，Ptch1-lacZ在Gli2突變型胚胎神經(jīng)管上的表達與野生型Gli2胚胎相比輕微增高，并且在背側分布更廣。
　

15、　 [討論]
　　 Ptch1是Gli2轉錄作用的靶基因，Ptch1表達增強表明Gli2轉錄活性增強。因此，該實驗表明在小鼠體內，突變型Gli2K2R活性比野生型Gli2輕微增高，表明在體內Sumo化修飾抑制Gli2轉錄活性。
　　 第二節(jié)細胞培養(yǎng)研究中Sumo化修飾對Gli2蛋白轉錄活性的影響
　　 [目的]
　　 使用雞胚肢芽原代細胞微團培養(yǎng)，體外實驗中測定Sumo修飾對于Gli2蛋白轉錄活性的影響

16、。
　　 [方法]
　　 制備攜帶兩個Sumo化位點K630、K716單個或全部突變的變異型Gli2基因的載體質粒(pRKGli2K630R、pRKGli2K716R、pRKGli2K630/716R)，將熒光素酶報告基因質粒、海腎熒光素酶內參質粒、pRK-Gli2及上述攜帶變異Gli2基因的質粒轉染入雞胚肢芽微團培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)36小時后裂解細胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測盒檢測各類轉染細胞熒光素酶活性，與海腎熒光素酶活

17、性標準化后，繪制熒光素酶相對活性圖表。
　　 [結果]
　　 過度表達的野生型Gli2蛋白使報告基因活性增高約10倍，Gli2K630R、Gli2K716R蛋白使報告基因活性增高的程度比野生型Gli2蛋白輕微增高，而Gli2K630/716R蛋白使報告基因活性增高約30余倍。
　　 [討論]
　　 這些結果表明，Sumo化修飾使Gli2轉錄活性受到抑制。在培養(yǎng)細胞中，單個Sumo化修飾位點作用不明顯而各個

18、Sumo化修飾位點相互協(xié)同，共同作用，對Gli2轉錄活性起明顯抑制作用。
　　 第三章Gli2蛋白Sumo化修飾的影響因素及作用機制研究
　　 第一節(jié)Gli2蛋白Sumo化修飾的影響因素
　　 [目的]
　　 PKA磷酸化可抑制Gli2蛋白活性，而Hh信號可促進Gli2蛋白活性激活，因此我們想知道Gli2蛋白Sumo化修飾是否也會受PKA磷酸化和Hh信號的影響。
　　 [方法]
　　 1、

19、使用雞胚肢芽原代細胞微團培養(yǎng)，將野生型Gli2基因及6個磷酸化位點中單個或多個位點突變的變異型Gli2基因分別與HA-Sumo2基因一起在雞胚肢芽微團培養(yǎng)細胞中表達，將細胞裂解提取蛋白，用Gli2抗體對細胞蛋白進行免疫沉淀作用，用HA抗體行免疫印跡實驗，測定不同磷酸化位點突變情況下Gli2蛋白Sumo化修飾水平的變化;
　　 2、將Gli2基因和HA-Sumo2基因單獨或一起在雞胚肢芽微團細胞中表達，加入ShhN條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)

20、過夜后裂解細胞提取蛋白，用Gli2抗體對細胞蛋白進行免疫沉淀作用，用HA抗體進行免疫印跡實驗，測定Hh信號對于Gli2蛋白Sumo化修飾水平是否有影響。
　　 [結果]
　　 1、在磷酸化位點突變的Gli2基因表達的細胞中，與野生型Gli2蛋白Sumo化修飾的水平相比，變異型Gli2P5-6蛋白Sumo化修飾水平略降低，變異型Gli2P1-4蛋白Sumo化修飾水平降低明顯，變異型Gli2P1-6蛋白Sumo化修飾水平降低

21、最為明顯。
　　 2、對表達Gli2基因和HA-Sumo2基因的細胞使用ShhN條件培養(yǎng)液，施加Hh信號刺激，與使用普通培養(yǎng)液表達相同基因的細胞相比，Gli2蛋白Sumo化修飾水平降低。
　　 [討論]
　　 這些結果顯示，6個PKA磷酸化位點的突變和Hh信號刺激都可以抑制Gli2蛋白Sumo化修飾作用，提示我們，PKA對Gli2蛋白的磷酸化過程對Gli2蛋白Sumo化修飾有正性調節(jié)作用。
　　 第二節(jié)G

22、li2蛋白Sumo化修飾作用機制的研究
　　 [目的]
　　 探究Sumo化修飾對Gli2轉錄活性抑制的分子作用機制，研究野生型Gli2、突變型Gli2與組蛋白脫乙酰酶(HDACs)之間的相互作用。
　　 [方法]
　　 將野生型Gli2基因和兩個Sumo化位點突變的變異型Gli2基因Gli2K630/716R與flag標記的HDAC4基因和HDAC5基因分別在HEK293細胞中表達，將細胞裂解提取蛋白，

23、各取少量細胞蛋白分別用Flag抗體和Gli2抗體行免疫印跡實驗，剩余大部分細胞蛋白用Gli2抗體行免疫沉淀作用，然后用Flag抗體行免疫印跡實驗，測定各類基因的蛋白表達量。
　　 [結果]
　　 1、HDAC4蛋白表達水平比HDAC5表達水平要低。
　　 2、免疫共沉淀實驗表明，Gli2抗體可以沉淀殘余的HDAC5，即便Gli2蛋白沒有過表達。當Gli2與HDAC5共表達的時候，HDAC5被沉淀的蛋白量明顯增高。

24、
　　 3、當HDAC5與Gli2K630/716R共表達的時候，HDAC5被沉淀的蛋白量與其單獨表達時候的蛋白量相近。
　　 4、當HDAC4與Gli2或Gli2K630/716R共表達時，HDAC4被沉淀的蛋白量相似。
　　 [討論]
　　 與HDAC4相比，Gli2優(yōu)先與HDAC5相結合。只有Gli2能與HDAC5結合，而Gli2K630/716R不能與HDAC5相結合。我們的結論是Sumo化修飾抑