Hippo信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄效應(yīng)因子TAZ-YAP在乳腺癌中作用的初步研究.pdf

1、乳腺癌已經(jīng)成為當(dāng)今威脅女性健康的最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)2014年發(fā)布的統(tǒng)計(jì)表明，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率分別居于女性惡性腫瘤中的第一位和第二位。我國(guó)的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌在我國(guó)不僅發(fā)病率和死亡率逐年增加，而且發(fā)病年齡也趨于年輕化。乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，無(wú)論在生物學(xué)行為、免疫表型、組織形態(tài)還是治療反應(yīng)上都存在著極大的差異。隨著乳腺癌腫瘤分子生物學(xué)研究的進(jìn)步，近年來(lái)，有研究者將乳腺癌再分為數(shù)個(gè)亞型，其中一種叫三陰性

2、乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)，即激素受體(estrogen receptor，ER)，孕激素受體(progesterone receptor，PR)，和人表皮生長(zhǎng)因子受體2(epidermal growth factor receptor2，HER-2/neu)均不表達(dá)，雖然三陰性乳腺癌的發(fā)病率較低，約占所有乳腺癌的10％-15％，但其侵襲性強(qiáng)、惡性程度高且預(yù)后差。由于缺乏相應(yīng)受體表達(dá)，

3、傳統(tǒng)內(nèi)分泌治療及靶向藥物赫賽汀療效差。雖然有研究報(bào)道高達(dá)80％的三陰性乳腺癌中人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)高表達(dá)，但是，令人遺憾的是，臨床試驗(yàn)中，EGFR的靶向藥物對(duì)三陰性乳腺癌患者未顯示顯著療效，其內(nèi)在機(jī)制亟需研究。Hippo信號(hào)通路是近年來(lái)首先在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一條細(xì)胞信號(hào)通路，該通路在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。它的主要功能包括調(diào)控器官體積、維持機(jī)體細(xì)胞增殖凋亡平衡，參與細(xì)胞接觸性抑制的調(diào)節(jié)，通路的調(diào)控異常導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。YAP(Yes-a

4、ssociated protein)和TAZ(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif)是哺乳動(dòng)物Hippo通路下游最主要的效應(yīng)器，功能上，TAZ和YAP主要作為轉(zhuǎn)錄共激活因子和多功能的細(xì)胞內(nèi)連接蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和對(duì)其下游靶因子的轉(zhuǎn)錄共激活過(guò)程，促進(jìn)或抑制細(xì)胞的增殖和凋亡，控制組織器官的正常體積及機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。已有研究報(bào)道，TAZ能促進(jìn)EGFR配體雙調(diào)蛋白(ARE

5、G)的表達(dá)，從而使乳腺癌細(xì)胞MCF10A不依賴生長(zhǎng)因子(EGF)增殖;YAP能夠EGFR啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)EGFR的表達(dá)，下調(diào)YAP能夠提高食管癌細(xì)胞對(duì)氟尿嘧啶、多西紫杉醇的敏感性，提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑厄洛替尼的敏感性。
　　目的：本課題旨在研究TAZ/YAP與人乳腺癌的關(guān)系，特別是與三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展及EGFR靶向藥物不敏感的關(guān)系，并初步探討其內(nèi)在機(jī)制。
　　方法：采用Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)

6、，檢測(cè)TAZ和YAP在4種人乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況（MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-468，BT-549），選取TAZ高表達(dá)的細(xì)胞株進(jìn)行研究。設(shè)計(jì)能干擾TAZ基因表達(dá)的短發(fā)夾RNA(shRNA)，并構(gòu)建慢病毒載體;對(duì)比細(xì)胞在TAZ下調(diào)前后對(duì)EGFR靶向抑制藥物吉非替尼和AG-1478敏感性的變化。采用細(xì)胞體外增殖曲線、平板克隆以及流式細(xì)胞儀研究TAZ下調(diào)對(duì)細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。利用小干擾RNA（siRNA）下調(diào)YAP

7、基因表達(dá)，觀察對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，利用RT-PCR和Western blot方法研究YAP下調(diào)后引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　結(jié)果：TAZ在三陰性乳腺癌細(xì)胞株的表達(dá)均高于激素受體陽(yáng)性的MCF-7細(xì)胞;成功建立TAZ穩(wěn)定下調(diào)的BT-549和MDA-MB-231細(xì)胞。下調(diào)TAZ后，BT-549細(xì)胞對(duì)吉非替尼和AG-1478的敏感性增加，但MDA-MB-231細(xì)胞卻對(duì)吉非替尼和AG-1478的敏感性下降;下調(diào)TAZ后，BT-549

8、細(xì)胞增殖抑制、凋亡增加，YAP表達(dá)無(wú)變化;而MDA-MB-231細(xì)胞呈現(xiàn)出增殖活躍、凋亡減少，YAP表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象，利用小干擾RNA再次抑制YAP后，MDA-MB-231細(xì)胞出現(xiàn)增值抑制、凋亡增加，恢復(fù)對(duì)吉非替尼和AG-1478的敏感性。提示下調(diào)TAZ對(duì)提高乳腺癌細(xì)胞的藥物敏感性具有細(xì)胞特異性，對(duì)TAZ和YAP都表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞需要同時(shí)抑制TAZ和YAP才能提高其對(duì)EGFR抑制劑的敏感性。下調(diào)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的YAP基

9、因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制、凋亡增加，PTEN表達(dá)上調(diào)、AKT通路抑制、caspase3和PARP活化，凋亡相關(guān)基因表達(dá)增加，應(yīng)用PTEN的特異性抑制劑bpv-Hopic后能夠部分解救下調(diào)YAP導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。提示YAP可能是通過(guò)PTEN/AKT通路來(lái)影響細(xì)胞增殖和凋亡的。
　　結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)TAZ/YAP能提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑的敏感性;首次提出在TAZ和YAP都表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系中，下調(diào)TAZ能夠