鋅指轉(zhuǎn)錄因子Slug招募LSD1在乳腺癌轉(zhuǎn)錄下調(diào)ERα的表達.pdf

1、背景與目的：乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性身心健康的疾病，雖然其新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)呈逐年遞增趨勢，但是隨著人們對乳腺癌認識的逐漸深入和治療方法的不斷優(yōu)化，死亡率無明顯上升。在乳腺癌中,雌激素受體α（ERα）不僅是分子分型的生物標(biāo)記、內(nèi)分泌治療的靶點，也參與到乳腺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和侵襲轉(zhuǎn)移的過程，被認為是乳腺癌重要的預(yù)后因子。ERα的缺失是三陰性乳腺癌的重要特征之一，此種類型的乳腺癌易于發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，缺乏有效的靶向治療，臨床預(yù)后較差

2、。乳腺癌中ERα缺失的機制是近年來的研究熱點。Slug是具有鋅指結(jié)構(gòu)的Snail超家族成員之一，在多種腫瘤中都可以轉(zhuǎn)錄抑制E-鈣粘素（E-cadherin）的表達，是促進 EMT的重要上游分子。賴氨酸特異性去甲基化酶1（LSD1）是在2004年首先發(fā)現(xiàn)的賴氨酸特異性去甲基化酶，當(dāng)它和不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后可以影響組蛋白不同位點賴氨酸的甲基化水平，發(fā)揮上調(diào)或者下調(diào)下游靶基因的作用。在本論文中，主要研究了Slug與 Erα的表達關(guān)系，Slug

3、調(diào)控Erα的機制，Slug/LSD1復(fù)合物對Erα的調(diào)控作用，以及Slug、LSD1對乳腺癌細胞生物學(xué)功能的影響。
　　材料和方法：
　　1)用免疫組化的方法在50例乳腺癌標(biāo)本中分析了Slug及Erα的表達情況，然后分析了The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫中Slug及Erα的mRNA和蛋白表達水平，驗證免疫組化的結(jié)果。同時利用該數(shù)據(jù)庫分析了Slug與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。利用在線網(wǎng)站 http:

4、//kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=breast分析了 Slug對預(yù)后的影響。
　　2)利用免疫印跡法、熒光實時定量PCR（RT-PCR）分別研究了在乳腺癌細胞株（MCF-7, T47D, MDA-MB-231, BT549, SKBR3）中Erα及Slug的蛋白和mRNA表達水平；采用免疫印跡法、RT-PCR和免疫熒光實驗研究了在Erα陽性乳腺癌細胞株 MCF-7、T

5、47D和 Erα陰性乳腺癌細胞株中 MDA-MB-231、BT549中Slu g對Erα的調(diào)控作用。
　　3)利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炑芯苛薙lug對ESR1啟動子活性的影響。用染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）的方法探究了Slug在ESR1啟動子的結(jié)合情況，進一步用ChIP-熒光定量PCR（qPCR）的方法定量研究在MDA-MB-231及其穩(wěn)定敲除Slug的細胞株MDA-MB-231shSlug，Slug在ESR1啟動子結(jié)合情況的變

6、化。
　　4)利用免疫印跡法、RT-PCR的方法分別在MCF-7和MDA-MB-231研究了LSD1單獨以及Slug和LSD1聯(lián)合對Erα的調(diào)控作用。在HEK293T和 MDA-MB-231細胞中用免疫共沉淀的方法探究了Slug和LSD1的結(jié)合情況及Slug的SNAG區(qū)域?qū)τ诖私Y(jié)合的重要性。用ChIP-qPCR研究了在干擾Slug后LSD1在ESR1啟動子的結(jié)合情況變化。用LSD1的作用底物H3K4me2行組蛋白ChIP-qPCR

7、探究LSD1對Erα組蛋白的甲基化水平的影響。
　　5)用劃痕愈合實驗，細胞增殖，遷移侵襲，平板克隆形成實驗探討了 Slug和LSD1單獨及聯(lián)合對MDA-MB-231生物學(xué)功能的影響。
　　結(jié)果：
　　1)在50例乳腺癌標(biāo)本中，免疫組化結(jié)果示Slug與Erα負相關(guān)。TCGA數(shù)據(jù)庫示：在mRNA水平，Erα陰性的病人，Slug平均表達水平高；而Erα陽性的病人，Slug平均表達水平低；在蛋白水平，可以得到類似的結(jié)論。通過

8、Pearson’s R檢驗發(fā)現(xiàn)兩者的相關(guān)系數(shù)在mRNA水平為-0.1612，在蛋白水平為-0.3403。Slug和年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)累及情況、AJCC分期、轉(zhuǎn)移情況、human epidermal growth factor receptor2（HER-2）狀態(tài)無關(guān)，但是和ER、孕激素受體（PR）、分子分型高度相關(guān)：Slug高表達組，ER、PR表達水平低，基底型乳腺癌的比例高；Slug低表達組，ER、PR表達水平高，基底型乳腺癌的比

9、例低。通過分析Kaplan-Meierplots生存數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)在總體乳腺癌和Erα陽性亞組乳腺癌中，Slug mRNA水平與無復(fù)發(fā)生存（RFS），無遠處轉(zhuǎn)移生存（DMFS）沒有相關(guān)性；在Erα陰性亞組乳腺癌中，Slug高表達組的RFS、DMFS低，即易于發(fā)生復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移。
　　2)在MCF-7、T47D、MDA-MB-231、BT549、SKBR3乳腺癌細胞中，Slug和ERαmRNA和蛋白表達水平均呈負相關(guān)。在 Erα陽性的

10、乳腺癌細胞株MCF-7和 T47D中梯度過表達Slug引起Erα的下調(diào)；在Erα陰性的乳腺癌細胞株MDA-MB-231和BT549中干擾 Slug引起Erα的上調(diào)。熒光雙標(biāo)顯示，在MCF-7和T47D中過表達Slug時，細胞核區(qū)域出現(xiàn)代表Slug的紅色熒光，而該相應(yīng)區(qū)域代表Erα的綠色熒光減弱；在MDA-MB-231中干擾Slu g時，細胞核區(qū)域紅色熒光減弱，而該相應(yīng)區(qū)域綠色熒光增強。
　　3)雙熒光素酶實驗顯示：在 MDA-MB

11、-231細胞株中，當(dāng)梯度干擾 Slug時，ESR1 promoter1-luc和ESR1 promoter2-luc的活性逐漸上升，但ESR1 promoter3-luc活性無明顯變化；在MCF-7和MCF-7Slug細胞株中可以看到相類似的結(jié)果。ChIP結(jié)果顯示Slug能和ESR1啟動子上第1、3、4和6個潛在結(jié)合位點結(jié)合。
　　4)在MCF-7中，單獨干擾LSD1，引起Erα的下調(diào)，同時過表達Slug和干擾LSD1時，Erα的

12、下調(diào)更明顯；在 MDA-MB-231中，單獨干擾LSD1，引起Erα的上調(diào)，同時干擾Slug和LSD1時，Erα的上調(diào)更明顯。在HEK293T和 MDA-MB-231細胞中，免疫共沉淀顯示Slug與LSD1結(jié)合形成復(fù)合物，且Slug的SNAG區(qū)域?qū)τ诖私Y(jié)合至關(guān)重要。ChIP-qPCR顯示當(dāng)干擾Slug時，LSD1在ESR1啟動子上的結(jié)合會變?nèi)酰划?dāng)干擾LSD1時，ESR1組蛋白的H3K4二甲基化水平會升高。
　　5)在MDA-MB-