Hedgehog-Gli信號通路介導肝細胞癌侵襲轉移的作用及芍藥苷對其的影響.pdf

1、原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)為最常見的惡性腫瘤之一,死亡率居全球惡性腫瘤的第三位。其治愈率低,預后差,HCC的發(fā)生、發(fā)展極其快速隱匿,多數(shù)患者確診即為晚期,且病程發(fā)展迅速,中位生存時間僅為數(shù)月。肝炎病毒,黃曲霉素,酒精等是HCC的主要誘因。侵襲與轉移是導致其復發(fā)和治療失敗的主要原因。目前,HCC侵襲與轉移的確切機制尚不明確。
　　Hedgehog/Gli信號通路在哺乳動物胚胎的生長發(fā)育

2、中極為重要,它控制著脊椎動物內(nèi)胚層分化發(fā)育,是一個高度保守的中軸器官發(fā)育的形態(tài)發(fā)生通路。該信號通路與人類腫瘤的發(fā)生與發(fā)展關系亦為緊密,該信號異常激活最早在痣樣基底細胞癌綜合征中被證實,其后在基底細胞癌、胃癌、結直腸癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌,卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌及肝癌等腫瘤中也相繼被發(fā)現(xiàn)。
　　Hedgehog/Gli信號通路的異常激活在HCC的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。信號通路的glioma-associated on

3、cogene homolog(Gli),Patched(Ptch),Smoothened(Smo)在肝癌組織中表達明顯高于非腫瘤性肝組織,而該通路的抑制蛋白Hip1在肝癌組織中表達明顯低于非腫瘤性肝組織;一些肝癌細胞株也存在該通路的異常表達與激活而參與肝細胞癌的增殖、凋亡等過程,該通路的抑制如KAAD-cyclopamin(KAAD-cyc),Gli siRNA等則減少了肝癌細胞的凋亡與增殖;Smo siRNA敲除Smo后同樣阻礙了肝癌

4、細胞的體內(nèi)外的生長;同時Hedgehog信號通路還參與了HCC干細胞的信號轉導。同時該信號通路對多種類型細胞轉移與遷移的控制及血管形成發(fā)揮重要作用,該信號通路還參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤、卵巢癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌等腫瘤的再生、侵襲與轉移。但該信號通路參與HCC的侵襲與轉移的作用及機制未見系統(tǒng)報道。
　　天然藥物在腫瘤的治療中發(fā)揮著十分重要的作用。白芍是治療肝病的重要組方之一,近年來對其保肝作用的研究逐漸增多。白芍的有效部位白芍

5、總苷(Total glucosides of paeony,TGP)對免疫性肝纖維化大鼠有顯著的治療作用,同時TGP通過細胞周期阻滯,抑制肝癌細胞HepG2和SMMC-7721的增殖和凋亡。芍藥苷(Paeoniflorin,Pae)是TGP的主要活性成分,但Pae對HCC侵襲轉移的影響未見報道。
　　基于以上的認識,本研究擬探討Hedgehog/Gli通路介導HCC的侵襲轉移作用及其可能的機制;同時考察Pae對HCC侵襲轉移的影響

6、及對HCC中Hedgehog/Gli通路的干預作用。以探討HCC的侵襲轉移新機制,尋求HCC治療新靶點,并針對該靶點尋找有效抑制HCC侵襲轉移的抑制劑。
　　目的:
　　1.考察Hedgehog/Gli通路介導HCC侵襲轉移的作用;
　　2.探討Hedgehog/Gli通路介導HCC侵襲轉移的可能機制;
　　3.考察Pae對HCC侵襲轉移的影響;
　　4.探討Pae抑制HCC侵襲轉移的可能機制。
　　

7、方法:
　　1.免疫組化檢測正常肝組織、轉移或非轉移HCC患者肝組織以及人肝細胞癌Bel-7402細胞中Shh,Gli-1,p-ERK1/2和MMP-9的蛋白表達;
　　2.Spearman相關檢驗分析HCC肝癌組織Shh,Gli-1,p-ERK1/2和MMP-9蛋白與HCC臨床病理參數(shù)的相關性,同時分析肝細胞癌肝組織中Gli-1,p-ERK1/2和MMP-9三者之間的相關性;
　　3.Wound-healing劃痕實

8、驗檢測通路配體Shh,通路抑制劑KAAD-cyc,MAPK通路的抑制劑U0126和PD98059及Pae對人肝癌Bel-7402細胞轉移運動能力的影響;4.Transwell侵襲實驗檢測Shh,KAAD-cyc,U0126,PD98059及Pae對人肝癌Bel-7402細胞侵襲能力的影響;
　　5.細胞粘附實驗檢測Shh,KAAD-cyc,U0126,PD98059及Pae對人肝癌Bel-7402細胞粘附能力的影響;
　　6

9、.MTT法檢測Pae對肝癌Bel-7402細胞增殖能力的影響;
　　7.Western blot檢測Shh,KAAD-cyc,U0126,PD98059及Pae對人肝癌Bel-7402細胞Shh,Gli-1,p-ERK1/2及MMP-9蛋白表達的影響。
　　結果:
　　1.與未侵襲轉移性HCC組比較,Shh,Gli-l蛋白在侵襲轉移性HCC肝癌組織表達顯著增加,Shh和Gli-1在非轉移性肝細胞癌的陽性率為57.14％

10、和44.90%,二者在轉移性肝細胞癌的陽性率均升高到81.08%。同時侵襲轉移性HCC肝癌組織中p-ERK1/2,MMP-9蛋白的表達也顯著增加,差異有顯著性,而正常肝組織中幾乎不表達Shh,Gli-1,p-ERK1/2和MMP-9蛋白;
　　2.肝癌組織Shh,Gli-1,p-ERK1/2和MMP-9蛋白的表達與HCC的侵襲轉移的密切相關(P=0.035,0.001,0.001,0.008);肝癌組織中Shh,Gli-1和p-E

11、RK1/2蛋白表達還與肝癌分化程度具有負相關(P=0.004,0.034,0.042);同時肝癌組織中Gli-1與p-ERK1/2,Gli-1與MMP-9之間具有相關性(P=0.031,P=0.034);
　　3.Shh(0.13μg·mL-1,0.5μg·mL-1)能明顯增加肝癌細胞Bel-7402的侵襲、轉移及粘附;
　　4.KAAD-cyc(1μmol·L-1,4μmol·L-1)則顯著減少了肝癌細胞Bel-7402的

12、侵襲、轉移及粘附;
　　5.U0126(5μmol·L-1,10μmol·L-1)和PD98059(5μmol·L-1,10μmol·L-1)均明顯抑制了肝癌細胞Bel-7402侵襲與轉移;
　　6.Shh(0.13μg·mL-1,0.5μg·mL-1)顯著增加了肝癌細胞Bel-7402的Gli-1,p-ERK1/2及MMP-9的蛋白表達;
　　7.KAAD-cyc(1μmol·L-1,4μmol·L-1)明顯減少了肝

13、癌細胞 Bel-7402中 Gli-1, p-ERK1/2及MMP-9的蛋白表達;
　　8.U0126(5μmol·L-1,10μmol·L-1)和PD98059(5μmol·L-1,10μmol·L-1)均明顯抑制了肝癌細胞Bel-7402中p-ERK1/2,MMP-9的蛋白表達,但二者對肝癌細胞Bel-7402 Gli-1蛋白表達均無顯著影響;
　　9.芍藥苷(6.25μmol·L-1,12.5μmol·L-1,25μm

14、ol·L-1)明顯減少了肝癌細胞Bel-7402的侵襲、轉移及粘附,同時顯著減少肝癌細胞Bel-7402中Gli-1,p-ERK1/2及MMP-9的蛋白表達。
　　結論:
　　1.Hedgehog/Gli信號通路參與了HCC的侵襲轉移;
　　2.Hedgehog/Gli信號通路參與HCC的侵襲轉移的機制可能與該通路激活后,上調(diào)MAPK/ERK信號通路、增加MMP-9蛋白的表達有關;
　　3.Pae能顯著抑制HCC