同型半胱氨酸與胰島β細胞胰島素分泌功能及細胞凋亡的關系及機制的研究.pdf

1、胰島β細胞功能受損和胰島素抵抗是2型糖尿病的兩個重要發(fā)病機制，不同人群在疾病的發(fā)展不同階段，這兩種異常的側重點有所不同，但只有β細胞功能缺陷、分泌胰島素的質(zhì)和量不足以維持正常葡萄糖代謝和難以克服胰島素抵抗時才會出現(xiàn)臨床高血糖。已有研究表明，β細胞功能受損與β細胞數(shù)量減少有關。一項尸檢研究發(fā)現(xiàn)，空腹血糖受損(IFG)者和2型糖尿病患者β細胞數(shù)量均明顯減少，并以后者為著；而且糖尿病患者體內(nèi)β細胞凋亡頻率明顯增高，但增生、復制功能正常，說明β

2、細胞凋亡增加是其數(shù)目減少的主要原因。細胞凋亡(apoptosis)是不同于細胞壞死的一種死亡形式，指細胞在生理或病理情況下發(fā)生有序的主動的非炎癥死亡，又稱程序性死亡。 目前有關2型糖尿病β細胞凋亡機制的研究大多數(shù)集中在高糖毒性和脂毒性的作用上。長期的高血糖狀態(tài)可通過氧化應激或非氧化應激途徑誘導β細胞凋亡，導致胰島素分泌減少和β細胞功能衰竭。在高糖條件下，可能通過改變Bcl基因家族中的平衡引起胰島β細胞凋亡。氧化損傷是引起許多組織

3、細胞凋亡的一個重要機制。與其他組織細胞相比，胰島細胞內(nèi)抗氧化物酶水平較低，因此，在一些因素的誘導下，容易發(fā)生氧化應激反應。而氧化和抗氧化作用失衡所致氧化應激引起胰島β細胞損傷是糖尿病發(fā)生、發(fā)展的一個重要機制。 國內(nèi)外研究者對同型半胱氨酸致血管內(nèi)皮細胞損傷和對神經(jīng)細胞損傷已做了深入研究。但有關同型半胱氨酸對β細胞產(chǎn)生的可能影響的研究甚少。研究表明氧化應激機制在同型半胱氨酸致血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)損傷中均起著重要作用。本研究通過觀察不同

4、糖耐量人群血漿同型半胱氨酸水平和胰島細胞功能變化，探討同型半胱氨酸對胰島細胞功能存在的可能的影響。并進一步通過體外實驗，用一種轉基因來源的小鼠β細胞系NIT-1細胞，通過觀察同型半胱氨酸作用下細胞生長率和胰島素分泌的改變以及是否促使NIT-1細胞發(fā)生凋亡，來探討同型半胱氨酸對胰島β細胞功能存在的可能負性影響，探討氧化應激機制在β細胞損傷中的作用，為糖尿病的治療和胰島功能的保護提供新的思路。本研究共分為兩部分: 一、不同糖耐量人群

5、血漿同型半脫氨酸水平與胰島素抵杭及胰島β細胞功能關系的研究 目的：觀察不同糖耐量階段血漿同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)水平，探討Hcy與胰島素抵抗和胰島β細胞功能的關系。 方法: 選擇12個月內(nèi)在我院健康查體的83名符合入選標準的個體，均行標準口服75克葡萄糖耐量試驗，留取空腹血標本測定血脂、肝腎功能、空腹胰島素、空腹血糖、Hcy、CRP等指標，留取服糖后2小時血標本測定餐后2小時血糖和胰島素

6、水平。同時留取尿液標本測量尿微量白蛋白/肌酐水平。Hcy采用免疫熒光偏振法測定。 結果: 所有入選個體經(jīng)糖耐量試驗證實有32例糖耐量正常(NGT)者，24例糖耐量減低(IGT)者和27例新診斷糖尿病(DM)者。血清CRP水平在NGT、IGT、DM各組中逐漸升高(P＜0.001)。IGT組和DM組腰圍、BMI顯著高于NGT組(P＜0.05，P＜0.01)。IGT組和DM組收縮壓均明顯高于NGT組(P＜0.01，P＜0.01

7、)，IGT組舒張壓明顯高于NGT組和DM組(P＜0.01，P＜0.01)。IGT組和DM組甘油三酯水平明顯高于NGT組，DM組總膽固醇水平顯著高于NGT組和IGT組，NGT組和IGT組總膽固醇水平無顯著差異(P＞0.05)。IGT組血肌酐水平明顯高于NGT組和DM組(P＜0.05，P＜0.01)，DM組肌酐水平與NGT組之間無顯著差別(P＞0.05)。IGT組和DM組空腹Hcy水平明顯高于NGT組，差異具有顯著性(P＜0.01，P＜0.

8、01)，IGT組Hcy水平略高于DM組，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。IGT組空腹胰島素水平顯著高于NGT組和DM組(P＜0.01，P＜0.01)，NGT組和DM組之間空腹胰島素水平無顯著差異(P＞0.05)。IGT組和DM組餐后2小時胰島素水平顯著高于NGT組(P＜0.01，P＜0.01)，DM組餐后2小時胰島素水平顯著低于IGT組，差異具有顯著性(P＜0.01)。IGT組和DM組HOMA-IR顯著高于NGT組，差異具有顯著性(P

9、＜0.01，P＜0.01)，IGT組和DM組ISI顯著低于NGT組，(P＜0.01，P＜0.01)，NGT組和IGT組HBCI顯著高于DM組，(P＜0.01，P＜0.01)，NGT組和IGT組HBCI無顯著差異(P＞0.05)，經(jīng)HOMA-IR校正之后，NGT組HBCI/IR顯著高于IGT組，(P＜0.01)。IGT組FBCI顯著高于NGT組和DM組(P＜0.05，P＜0.01)，經(jīng)HOMA-IR校正之后，NGT組FBCI/IR顯著高于

10、IGT組和DM組(P＜0.05，P＜0.01)，IGT組FBCI顯著高于DM組(P＜0.01)。NGT組的ΔI120/ΔG120、ΔI120/ΔG120/IR顯著高于IGT組和DM組，差異具有顯著性(P＜0.01，P＜0.01)，IGT組ΔI120/ΔG120、ΔI120/ΔG120/IR顯著高于DM組，差異具有顯著性(P＜0.01)。Spearman相關分析顯示Hcy與HOMA-IR(r=0.335，P=0.030)，與ISI(r=-

11、0.335，P=0.030)呈顯著負相關，與HBCI(r=-0.260，P=0.096)、FBCI(r=-0.039，P=0.808)和△I120/ΔG120(r=-0.253，P=0.107)呈負相關，但未達統(tǒng)計學意義，經(jīng)HOMA-IR校正后，Hcy與HBCI/IR(r=-0.369，P=0.016)、FBCI/IR(r=-0.415，P=0.006)和△I120/ΔG120/IR(r=-0.335，P=0.030)呈顯著負相關性。多

12、元逐步回歸分析顯示，腰圍、尿Alb/Cr、FINS、HOMA-IR、FBCI和FBCI/IR對Hcy有顯著影響。 結論: 糖耐量異常患者較糖耐量正常人相比往往合并更多的代謝異常，代謝綜合征的發(fā)生率高。糖耐量異常患者胰島素抵抗、胰島β細胞功能受損程度明顯，且糖耐量受損者其血漿Hcy水平高于糖耐量正常者。胰島素抵抗和胰島β細胞功能受損與糖耐量異常者血漿Hcy水平明顯相關。 二、同型半胱氨酸對胰島β細胞胰島素分泌及凋亡

13、的影響及機制的研究 目的: 觀察同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)對克隆的胰島β細胞NIT-1細胞株胰島素分泌、細胞生存率及細胞凋亡的影響，以及對細胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的影響。 方法: 將Hcy作用于NIT-1細胞后，用放射免疫分析法檢測不同濃度Hcy作用不同時間后對細胞胰島素分泌的影響；用溴化(4，5二甲2噻唑基)2，5二苯基四氮唑分析法檢

14、測細胞生存率；流式細胞儀Annexin V/PI雙染色法和瓊脂糖凝膠電泳檢測不同濃度的Hcy作用不同時間對NIT-1細胞凋亡的影響；用黃嘌呤氧化酶法和WST結合的方法檢測Hcy作用后的NIT-1細胞內(nèi)SOD的活性。Western blot免疫印記法測定Bax和Bcl-2蛋白表達。 結果: 50μmol/L的Hcy作用24h以及100μmol/L的Hcy作用12h后，細胞胰島素的分泌量較正常對照組相比分別下降了17.1％和

15、10.8％，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01；P＜0.01)。100μmol/L的Hcy作用12h、24h后細胞存活率分別降至94.56％、87.93％，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)；50μmol/L的Hcy作用48h、72h后，細胞存活率分別降至91.26％、87.21％，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。當100μmol/L Hcy作用24h，NIT-1細胞凋亡率為7.

16、21％(P＜0.01)；250μmol/L的Hcy作用12h，NIT-1細胞凋亡率為12.93％(P＜0.05)。瓊脂糖凝膠電泳顯示隨著Hcy濃度增加，凋亡NIT-1細胞的DNA電泳條帶呈現(xiàn)為明顯的梯形條帶。100μmol/L的Hcy作用24小時后NIT-1細胞內(nèi)SOD活性較正常組細胞下降20.2％(P＜0.01)。隨著Hcy濃度的增加，Bax的蛋白表達逐漸增加(P＜0.05)。結論 Hcy對NIT-1細胞胰島素分泌的抑制作用呈時間、劑

17、量依賴性。Hcy對細胞的生存率具有抑制作用，且可以用時間和濃度依賴性的方式誘導NIT-1細胞凋亡。這些有害作用可能是通過抑制細胞內(nèi)的SOD的活性而發(fā)揮作用，為研究保護胰島細胞功能提供一種新的思路。 結論: 1．糖耐量異?；颊咭葝u素抵抗、胰島β細胞功能受損程度明顯，且糖耐量受損者其血漿Hcy水平高于糖耐量正常者。胰島素抵抗和胰島β細胞功能受損與糖耐量異常者血漿Hcy水平明顯相關。 2．同型半胱氨酸以時間、劑量依賴性