鴨FTH1基因啟動子區(qū)克隆及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析.pdf

1、大量研究證實鐵蛋白(FTH1)表達變化與肝炎密切相關(guān)。本課題組前期通過抑制性消減雜交技術(shù)也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TH1為雛鴨肝炎病毒侵染過程中表達下調(diào)的關(guān)鍵候選基因，對FTH1基因編碼區(qū)進行了測序分析，發(fā)現(xiàn)該基因的編碼區(qū)在雛鴨肝炎病毒(DHV-1)感染發(fā)病、未發(fā)病和對照組不同個體間僅發(fā)現(xiàn)有一處同義突變，其余未發(fā)生任何有義突變、缺失或重排。為了進一步揭示鴨FTH1基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機制，本研究主要開展了如下工作:
　　1.運用基因組步移擴增，成功

2、獲得了duFTH1基因ATG上游-1110 bp，并通過在線預(yù)測5'側(cè)翼序列含有一個典型的CpG島，同時還發(fā)現(xiàn)duFTH1基因的轉(zhuǎn)錄起始點附近存在Sp-1等多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點反式作用元件，且這些反式作用元件還位于CG二核苷酸位點上。BSP檢測結(jié)果顯示，鴨血液、脾臟組織中duFTH1基因啟動子區(qū)的CpG島處于低甲基化狀態(tài)，且發(fā)現(xiàn)DHV-1病毒感染后發(fā)病、未發(fā)病和對照組血液duFTH1基因的甲基化程度均處于低甲基化狀態(tài)。
　　2.通

3、過制備一系列啟動子缺失突變體:pGL3-Basic-M1(+145～-765)、pGL3-Basic-M2(+145～-486)、pGL3-Basic-M3(+145～-265)、pGL3-Basic-M4(+145～-144)、pGL3-Basic-M5(+145～-35)、pGL3-Basic-M6(+145～-11)和pGL3-Basic-M7(+145～+50)，雙熒光素酶報告基因顯示在表達載體pGL3-M4和pGL3-M5（-

4、144 bp/-35 bp）之間存在重要的作用元件，對啟動子活性具有影響。對DHV-1病毒感染后發(fā)病、未發(fā)病組duFTH1基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性區(qū)(-144 bp/-35bp)序列進行了SNP篩查，發(fā)現(xiàn)在DHV-1不同處理組間僅存在1處堿基突變（-54 C＞T），alibaba2和jaspar軟件在線預(yù)測該突變位點還影響到轉(zhuǎn)錄因子NRF1結(jié)合。
　　3.為證實該SNP位點(-54 C＞T)的作用機制，對duFTH1基因核心啟動子區(qū)可能

5、存在的轉(zhuǎn)錄因子NRF1結(jié)合位點進行了定點突變，雙熒光素酶報告基因顯示:突變重組質(zhì)粒(-54 T)熒光素酶活性極顯著高于未突變重組質(zhì)粒（-54 C）(P＜0.01)。為進一步驗證該位點的作用，繼續(xù)開展了凝膠電泳阻滯遷移分析(EMSA)，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)錄因子NRF1與duFTH1基因啟動子區(qū)序列能夠結(jié)合，而位點-54 C＞T突變明顯減弱了結(jié)合條帶，競爭性實驗及超凝膠阻滯實驗更進一步證實了結(jié)合的特異性。
　　由上可知，duFTH1基因轉(zhuǎn)錄