豬APC家族3個(gè)基因克隆鑒定、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及與性狀關(guān)聯(lián)分析研究.pdf

1、促后期復(fù)合物(anaphase promoting complex,APC)是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的泛素連接酶,可通過泛素--蛋白酶體途徑降解與有絲分裂相關(guān)的調(diào)節(jié)因子,以保證有絲分裂的有序進(jìn)行和適時(shí)退出。APC通過降解securin,促進(jìn)細(xì)胞從分裂中期向后期轉(zhuǎn)化；通過降解cyclinB,促進(jìn)細(xì)胞退出本次有絲分裂,向下個(gè)周期的G1期轉(zhuǎn)化。APC的活性受阻時(shí)有絲分裂紡錘體檢測點(diǎn)活性會增加,這提示APC的失調(diào)會導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定。由于人類大多數(shù)惡

2、性癌變均表現(xiàn)出染色體的增減,所以染色體不穩(wěn)定被認(rèn)為是惡性病變的因?yàn)?。而且一些APC作用的靶分子,比如securin、polo-likekinase、aurora kinase和SnoN,已被證明是致癌基因。因此APC的失調(diào)可能與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。
　　 哺乳動(dòng)物的APC家族至少有11種核心蛋白亞基。本試驗(yàn)克隆了豬的APC7、APC10和APC133個(gè)基因的部分cDNA、內(nèi)含子和5’側(cè)翼端(啟動(dòng)子區(qū)域)序列,對它們在豬各器官的表達(dá)、

3、在不同物種中的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析。尋找和鑒定了豬APC7和APC13基因組序列中的若干SNPs位點(diǎn)和InDels位點(diǎn),與一系列生長和免疫性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析,為進(jìn)一步研究該家族基因的作用奠定了基礎(chǔ),并為其將來運(yùn)用于標(biāo)記輔助育種提供了依據(jù)。另外,本試驗(yàn)對豬APC7和APC10基因啟動(dòng)子區(qū)域的活性以及轉(zhuǎn)錄因子Sp1蛋白與豬APC7、APC10和APC133個(gè)基因的互作做了初步的研究,主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)以人同源基因的cDN

4、A序列為探針,從GenBank中搜索豬的同源性大于80％的EST序列,以EST構(gòu)成的連接群設(shè)計(jì)引物,從豬的基因組中分離克隆了APC7、APC10和APC13基因的完整編碼區(qū)序列(coding sequence,CDS)和部分基因組序列。對此3個(gè)基因的mRNA以及蛋白預(yù)測序列序列進(jìn)行了物種同源基因序列比對分析。結(jié)果顯示這3個(gè)基因在種內(nèi)和種間都是相當(dāng)保守的。
　　 (2)利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測了APC7、APC10和APC13基

5、因在豬不同器官組織中的表達(dá)情況,探明了豬APC7、APC10和APC13基因的組織表達(dá)規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在檢測的成年五指山豬心臟、肝臟、脾、肺、腎、骨骼肌、淋巴結(jié)、胸腺等器官內(nèi)均有表達(dá),且各器官間的表達(dá)水平差異較小。
　　 (3)在中外豬群中利用PCR-RFLP、AS-PCR等方法分別對豬APC7的2個(gè)SNPs位點(diǎn)和2個(gè)Indels位點(diǎn)以及APC13基因的1個(gè)Indel位點(diǎn)進(jìn)行了判型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)中外豬種在這些多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率上表現(xiàn)出

6、較大差異。
　　 (4)將發(fā)現(xiàn)的SNPs位點(diǎn)和Indels位點(diǎn)基因型與溫氏(長白)試驗(yàn)豬群的生長形狀和免疫性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示豬APC7基因第4內(nèi)含子上SNP(A/G)位點(diǎn)與血小板計(jì)數(shù)顯著相關(guān)(P值為0.0427)；第5內(nèi)含子上SNP(T/G)位點(diǎn)與32日齡仔豬血小板分布寬度、平均血小板容積和大血小板細(xì)胞比率顯著相關(guān)(P值分別為0.0175,0.0383和0.0213)；啟動(dòng)子區(qū)域InDel(45bp)不同的基因型在初生

7、重存在顯著性差異(P<0.05),在斷奶重存在極顯著差異(P<0.01)。而豬APC13基因第1內(nèi)含子上InDel(TGC)與17日齡仔豬的絕對淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和32日齡仔豬紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度顯著相關(guān)(P值分別為0.0457和0.0455)。
　　 (5)采用熱不對稱交錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Tail-PCR)技術(shù)克隆得到了豬APC7、APC10和APC13基因的5’側(cè)翼端(啟動(dòng)子區(qū)域)序列,利用啟動(dòng)子分析軟件TESS對基因啟動(dòng)子中可