豬CIDE家族基因的克隆及功能研究.pdf

1、梅山豬是我國優(yōu)秀地方豬種，是國內(nèi)外豬遺傳育種的重要品種資源，其重要功能基因的克隆、分析鑒定和生物學特性研究有助于積累和開發(fā)利用我國重要地方豬種的基因資源信息，為優(yōu)良豬種的遺傳改良提供理論依據(jù)。 在真核生物中，細胞凋亡是一種進化上保守的現(xiàn)象，它在調(diào)節(jié)正常細胞的活性方面發(fā)揮著十分重要的作用。在細胞凋亡過程中，DNA的片段化是一個關(guān)鍵的步驟，它是由DNA片段化因子(DFF)所誘導的。DFF含有兩個亞基，一個是核酸酶(DFF40)，另一

2、個是它的抑制物(DFF45)。最近發(fā)現(xiàn)了一個新的誘導細胞死亡的類似DFF45的蛋白家族(celldeath-inducingDFF45-likeeffectors，CIDEs)，CIDE蛋白的過度表達可以導致細胞凋亡的發(fā)生。在CIDE蛋白家族中，己報道有三個成員來源于人(hCIDEa、hCIDEb和hCIDEc)，三個成員來源于小鼠(mCIDEa，mCIDEb和脂肪特異性蛋白27(Fat-specificproteinof27kDa，F(xiàn)

3、SP27：是人CIDEc在小鼠中的同源蛋白)，但在豬上還未見有報道。 CIDE蛋白家族除了具有前凋亡蛋白的功能外，在脂代謝和脂肪細胞分化調(diào)控過程中也有很重要的作用，所以將其作為人類肥胖的候選基因之一。本文以豬為研究對象，首次對豬CIDE家族的3個基因及CIDEb的剪接體進行了基因克隆，通過基因組PCR獲取基因組序列并對其進行基因結(jié)構(gòu)分析，利用輻射雜種細胞板技術(shù)和半定量RT-PCR等方法進行了基因的染色體定位和組織表達分析；同時研

4、究了它們在遺傳脂肪型豬(通城豬)和瘦肉型豬(大白豬)組織中的表達差異；另外還通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建基因編碼區(qū)及啟動子區(qū)域的真核或原核細胞表達載體，以豬腎細胞系IB細胞為研究對象，通過細胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染，實現(xiàn)目的基因的離體細胞超表達，從而對其表達調(diào)控進行初步研究。研究結(jié)果如下： 1、擴增得到梅山豬CIDE家族3個成員的包含全長編碼區(qū)及部分非編碼區(qū)的cDNA序列，并對其進行了生物信息學的分析。其中CIDEa和CIDEb編碼區(qū)均為660

5、bp，編碼219個氨基酸；CIDEc編碼區(qū)為717bp，編碼238個氨基酸。在蛋白質(zhì)水平上，CIDEa與人、小鼠CIDEa分別享有80.5％，75.8％的相似性；CIDEb與人、小鼠CIDEb分別享有85.8％，80.0％的相似性；CIDEc與人、小鼠CIDEc分別享有82.8％，73.2％的相似性。證明CIDE蛋白具有較強的保守性，預示著其重要的生理作用。 2、擴增獲得CIDEb的基因組序列、CIDEa和CIDEc的內(nèi)含子序列

6、，并利用生物信息學方法得到豬CIDEc的全長基因組序列。根據(jù)所得到的基因組及內(nèi)含子序列設(shè)計引物，用輻射雜種板技術(shù)將CIDEa、CIDEb和CIDEc分別定位在6q21-26、7q21和13q31。并且這3個基因的定位結(jié)果與人基因組中相應(yīng)基因的染色體位置相對應(yīng)。 3、以梅山豬的脂肪組織、骨骼肌、心、胃、肝、肺、脾、腸、腦、腎、淋巴等十一個組織樣品為材料，用半定量RT-PCR的方法研究了CIDE家族在mRNA水平上的組織表達譜。結(jié)果

7、表明CIDEa、CIDEb和CIDEc均在脂肪組織中高量表達、在淋巴組織中大量表達。另外，CIDEa在脾、肺、腎、肝、腦和胃中較多量表達，在小腸、肌肉和心臟中微量表達；CIDEb在肝、小腸、腦中大量表達，在脾、肺、腎中較多量表達，在胃、肌、心中微量表達；而CIDEc在小腸、腦中大量表達，在肺、腎和肝中較多量表達，在其他組織中微量表達。 4、以遺傳脂肪型豬(通城豬)和遺傳瘦肉型豬(大白豬)的組織樣品為材料，對mRNA水平上CIDE

8、家族在兩種不同類型豬中的組織表達差異進行了研究。結(jié)果顯示CIDEa和CIDEc基因在通城豬脂肪和肝臟中的表達量高于大白豬的相應(yīng)組織，而CIDEb基因在通城豬脂肪中的表達量卻低于大白豬的相應(yīng)組織。 5、實驗結(jié)果證實在豬中存在CIDEb的一個差異剪接體CIDEb2，得到包含432bp全長編碼區(qū)的的652bp的cDNA序列，編碼143個氨基酸，它是由野生型CIDEb發(fā)生191bp的缺失所產(chǎn)生。通過半定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)CIDEb2

9、除了在胃中沒有檢測到外，在其他組織中都有表達，但是表達量比CIDEb少得多。通過對人和鼠的EST、mRNA數(shù)據(jù)庫進行檢索分析，沒有檢測到CIDEb的這種特異性的剪接體CIDEb2，說明這種剪接方式可能只存在于豬中。 6、對豬CIDEb的基因組序列進行了CpG島和核心啟動子區(qū)域的生物信息學分析，并在預測的啟動子區(qū)域進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析，發(fā)現(xiàn)具有PPAR/RXR、NF-кB、CREB、SREBP、HNF-4α、KLF15和HMG

10、Afamily等轉(zhuǎn)錄因子的識別位點。并將豬CIDEb核心啟動子序列構(gòu)建成不同長短的啟動子雙熒光素酶報告載體及綠色熒光載體，轉(zhuǎn)染細胞以檢測驗證核心啟動子的區(qū)域及啟動子強弱。 7、通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法能夠有效地在豬腎細胞系IB細胞中超表達CIDEb。應(yīng)用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建了豬CIDEb的全長真核表達載體(CIDEb-pIRES-EGFP全長非融合綠色熒光真核表達載體、CIDEb-PcDNA3.1(-)超表達載體)，并在豬腎IB細胞中進