豬SCAP和INSIG家族基因的克隆、染色體定位及生物學特征研究.pdf

1、通過對豬的脂肪和膽固醇代謝相關(guān)基因，包括SCAP、INSIG1和INSIG2的克隆、染色體定位及其生物學特征的鑒定，探討豬的脂肪沉積的分子機理，為這些基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。 方法：1通過同源比較法，設(shè)計用于擴增特異基因的引物； 2利用RT-PCR技術(shù)，擴增特異基因的cDNA片段； 3利用5’和3’RACE技術(shù)，獲取特異基因的5和3’末端cDNA序列； 4對特異基因的擴增產(chǎn)物進行回收、克隆和測序；

2、 5利用RT-PCR技術(shù)，獲取特異基因的組織表達譜； 6通過基因組PCR獲取特異基因的基因組序列； 7利用輻射雜交板技術(shù)，對特異基因進行染色體定位。 結(jié)果：1.本研究獲得了505bp的INSIG1部分編碼區(qū)以及143bp的INSIG1差異剪接體(INSIG1variant3)。該差異剪接體由野生型INSIG1(INSIG1variant1)發(fā)生292bp的缺失所造成。豬INSIG1序列所編碼的INSIG1蛋白質(zhì)序

3、列和人INSIG1有97.6％的同源性。RT-PCR檢測表明INSIG1在心、肝、脾、肺、腎、腸、睪丸、腦、脂肪和肌肉中均有表達。INSIG1差異剪接體的表達在心臟和肌肉中沒有檢測到。對人、大鼠和小鼠EST數(shù)據(jù)庫的檢索和對小鼠來源的RNA進行的RT-PCR檢測表明，該差異剪接現(xiàn)象存在于在人和豬中，而在嚙齒類動物中沒有發(fā)生。 2.獲得了1295bp包含一個675bp全長編碼區(qū)的INSIG2cDNA。豬INSIG2序列所編碼的INS

4、IG2蛋白序列和人INSIG2有99.1％的同源性。RT-PCR檢測表明INSIG2在心臟，腦，脾臟，肺，肝臟，肌肉，腎臟，睪丸，腸，脂肪組織中均有表達。此外，本研究首次分離并且鑒定了一個具有轉(zhuǎn)錄活性的INSIG2擬基因。該擬基因與INSIG2功能基因有96.0％的序列同源性，不含內(nèi)含子序列，序列中含有多個堿基突變和缺失，其3’末端帶有一個polyA尾。對人、大鼠和小鼠全基因組數(shù)據(jù)庫的檢索和對猴類來源的DNA進行的PCR檢測表明，該擬基

5、因特異存在于豬基因組中。3.獲得了4045bp包含一個3870bp編碼區(qū)的SCAP全長cDNA。豬SCAP序列所編碼的SCAP蛋白序列和人SCAP有92.2％的同源性。RT-PCR檢測表明SCAP在肝臟，肺，腎臟，睪丸，腸，腦，肌肉和脂肪組織中均有表達。基因結(jié)構(gòu)分析表明，豬SCAP全長大于10Kb，由18個外顯子和17個內(nèi)含子組成。與人、小鼠和大鼠的SCAP基因相比較發(fā)現(xiàn)，豬SCAP基因的內(nèi)含子有丟失的現(xiàn)象。此外，本研究首次分離得到了兩

6、種SCAP差異剪接體。這兩種SCAP差異剪接體分別由野生型SCAP(SCAPvariant1)發(fā)生193bp(SCAPvariant2)和291bp(SCAPvariant3)的讀碼框內(nèi)缺失所造成。RT-PCR分析表明，SCAPvariant2在肝臟和肌肉中特異表達，而SCAPvariant3在睪丸中特異表達。對人、大鼠和小鼠EST數(shù)據(jù)庫的檢索和對小鼠來源的RNA進行的RT-PCR檢測表明，SCAP的差異剪接現(xiàn)象在人、大鼠和小鼠中沒有發(fā)

7、生。4.通過輻射雜交板技術(shù)，本研究將豬INSIG1、INSIG2、INSIG2擬基因和SCAP分別定位于豬染色體的18q21-23、15q14-15、7q21-q23以及13q21-22區(qū)域。 結(jié)論：1豬的INSIG1、INSIG2和SCAP與其它物種來源的對應(yīng)的基因有很高的同源性。 2豬的INSIG1存在差異剪接體，該基因的差異剪接現(xiàn)象在各物種間沒有保守性。 3豬基因組中第7號染色體上存在一個具有物種特異性的I